Evaluación in vitro de un nuevo proceso de refrigeración para la criopreservación de semen ovino

PELUFO, V.; MALCOTTI, V.; LÓPEZ ARMENGOL, M.F.; BERGAMO, N.; AISEN, E.G.

Puerto Madryn

Jornada; II Jornada de Becarios del CENPAT-CONICET 2011; 2011

CENPAT

Objetivos: Optimizar el proceso de refrigeración, evaluando la mejor combinación de procesos fisicoquímicos, en combinación con la variación del tiempo de equilibrio a 5ºC. Materiales y Métodos:El material seminal se obtuvo de machos Merino Australiano por medio de vagina artificial (Evans y Maxwell, 1990). Los eyaculados, luego de ser evaluados en forma individual y considerados aptos, se Libro de resúmenes- 2da Jornada de Becarios del CENPAT 62unieron en una mezcla heterospérmica, con la finalidad de minimizar factores individuales de los carneros. Una vez realizada la mezcla se procedió a su dilución en dos pasos. Se utilizó el diluyente S, compuesto por Tris-ácido cítrico-glucosa-yema de huevo y glicerol (Evans y Maxwell, 1990) y se lo contrastó con ST, compuesto por el mismo diluyente anterior con la incorporación de trealosa 100 mOsm (Aisen et al.; 2008). El glicerol y la trealosa fueron agregados a 30ºC o a 5ºC, en combinación con distintos tiempos de equilibrio. Los descensos de temperatura durante la refrigeración se realizaron en forma controlada por medio de un dispositivo refrigerado por celdas de efecto Peltier, diseñado y fabricado por los autores para los ensayos. La tasa de enfriamiento fue de -1ºC/min (de 30ºC a 5ºC) y los tiempos de equilibrio a 5ºC variaron de 0 a 1,5 h (0, 30, 60, 90 minutos).El semen se envasó a 5°C en pajuelas. La congelación se realizó en vapores de nitrógeno líquido a una tasa de 10º C/ minuto y luego se almacenaron en un termo con nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 30ºC durante 20 segundos, rediluyéndose el semen en un medio isotónico. La evaluación in vitro del semen fresco, refrigerado o descongelado; incluyo (según el caso) los siguientes parámetros: Motilidad individual (MI), Tinción supravital (% vivos), integridad funcional de la membrana plasmática (E+), Estado de la membrana acrosomal (AN), Estado de la cromatina espermática (SCSA) y Termorresistencia (TR-MI).Resultados: Se observó una interacción significativa entre método de dilución, diluyente y tiempo de equilibrio para MI, Eo-Ni y SCSA.Esta interacción fue mayor para tiempos de equilibrio de 0 min, donde se observa que los tratamientos con el agregado de glicerol o trealosa a 30ºC (Nº1 y Nº2) presentan los valores más bajos de MI (p=0,00026), AN (p=0,00527), E+ (p=0,04247), Eo-Ni (p=0,02553) y TR-MI (p=0,04559). De los tratamientos con trealosa, el Nº 3 (glicerol a 30ºC y trealosa a 5ºC) y el tratamiento Nº 6 (glicerol a 5ºC y trealosa a 5ºC) son los que manifestaron los mayores valores promedios de estos parámetros para 0 min (MI=43% y 50%, AN=47% y 38%, E+=36% y 28%, Eo-Ni=40% y 41%, TR-MI=27% y 28%, respectivamente). La determinación de la estabilidad de la cromatina espermática (SCSA) demostró, contrariamente, que a tiempos de equilibrio de 0 min, los tratamientos Nº 1, Nº2 y Nº6 fueron los que mejor mantuvieron la estabilidad de la cromatina (p=0,0004). Cuando se analizaron los diluyentes por separado, en función de diferentes tiempos de equilibrio a 5ºC, se observó que los tratamientos Nº 1 y 2 incrementaron los valores de MI, E+ y TR-MI conforme aumentaba el tiempo de equilibrio, mientras que el efecto fue inverso al considerar el parámetro SCSA. Por el contrario, el tratamiento Nº 3 mostró valores similares de MI (43% y 38%), E+ (36% y 31%) y TR-MI (26% y 28%) cuando se compararon a tiempo 0 min y a tiempo 90 min de equilibrio a 5ºC. Con el tratamiento Nº 6 se obtuvieron valores promedios similares para estos parámetros.Conclusion: La incorporación de trealosa a 5ºC en los diluyentes permitiría refrigerar el semen de 30ºC a 5ºC, sin considerar necesario el tradicional tiempo de equilibrio a esa temperatura, para su posterior congelación.