INVESTIGADORES
WUNDERLIN Daniel Alberto
congresos y reuniones científicas
Título:
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE FLAVONOIDES
Autor/es:
CHEMINET G.; BARONI, M.V.; PODIO, N.S.; LINGUA, M.; ASÍS, R.; WUNDERLIN D.A.; DI PAOLA, R.
Lugar:
Los Cocos
Reunión:
Congreso; I° Congreso Argentino de Espectrometria de Masa; 2012
Institución organizadora:
SAEM
Resumen:
Los
flavonoides son fitoquímicos ampliamente distribuidos en la naturaleza,
encontrándose en numerosos frutos, plantas y semillas. Su presencia en
productos alimenticios ha sido muy estudiada recientemente debido a sus
propiedades fisiológicas y a sus potenciales beneficios para la salud como
consecuencia de su acción antioxidante, quimiopreventiva y captadora de
radicales libres.
La familia de los flavonoides se
divide a su vez en varias subclases que comparten una estructura básica
conformada por un esqueleto C6-C3-C6, compuesto
por dos anillos fenilos (A y B) ligados a través de un anillo heterocíclico
oxigenado (C) (Fig. 1). Las diferencias entre las subclases radican en el grado
de hidroxilación, sustituciones y conjugaciones, y el grado de polimerización;
esta multitud de variaciones da lugar a flavanoles, flavonoles, flavonas, flavanonas
y chalconas, entre otros. Estos compuestos pueden encontrarse libres,
glicosilados o acilglicosilados, mayoritariamente en la posición 3 y con menor
frecuencia en las posiciones 7, 3´y 4´.
Numerosos trabajos demostraron que la
estructura del flavonoide se correlaciona con su actividad biológica y
antioxidante, por ello es importante la determinación funcional y estructural
de estas moléculas, utilizando técnicas como la espectrometría de masas (MS). El
objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de HPLC-ESI-MS/MS para
caracterizar flavonoides en diferentes matrices alimenticias (uvas tintas,
pistacho, tomate, yerba mate, café, trigo y naranja). Se utilizó un HPLC (Agilent Technologies), acoplado a un detector con
arreglo de diodos (DAD) y un espectrómetro de masas (MS). La separación se
realizó en una columna de fase reversa (C18) (5 mm, 250mm, 4.60 mm i.d.), termostatizada a 35 °C y aplicando un gradiente de solventes (A: ácido fórmico 0,5% v/v; B:
ácido fórmico 0,5% v/v en metanol) durante 41 min. El flujo aplicado fue de 0,4
mL/min. El MS consta de dos analizadores, un cuadrupolo
seguido de un tiempo de vuelo (microTof-Q II, Bruker). Se utilizó una interfase
de ionización por electrospray (ESI) y los espectros fueron registrados en modo
negativo. La optimización del método de análisis se
llevó a cabo utilizando estándares comerciales representando a las subfamilias
de flavonoides analizadas en el presente trabajo.
Las vías de fragmentación de
flavonoides glicosilados obtenidos por CID, permiten obtener información
importante de los patrones de sustitución de estos compuestos. De esta forma, el método desarrollado permitió la identificación de 43 flavonoides, algunos
de los cuales se muestran en la Tabla 1. Los mismos fueron identificados por sus tiempos de
retención (tr), espectros UV-Vis, relaciónes m/z, espectros de MS2 y comparación con datos
bibliográficos. Para los compuestos glicosilados, en todos los casos se observó
la eliminación del residuo glicosídico, generando como fragmento mayoritario el
aglicón correspondiente debido a que la unión hemiacetal es relativamente lábil
(ej. compuestos 4, 6, 7, 10, 11, etc.). Cuando un flavonoide esta sustituido
por dos residuos glicosídicos, es posible diferenciar si se trata de un biósido
o un diglicósido por su patrón de fragmentación. Por ejemplo, el compuesto 5 registra
el fragmento [M-308]- correspondiente a la pérdida conjunta de un
residuo ramnosa-hexosa, indicando la presencia de un sustituyente diglucósido
en una única posición (eriocitrina/neoeriocitrina). Teniendo en cuenta las
mismas consideraciones, fue posible identificar los compuestos 8, 10 y 11. Por
otra parte, se identificaron naringenina (flavanona) y naringenina-chalcona por
sus espectros UV-Vis. Debido a que ambos compuestos poseen la misma m/z y el mismo tr, fue posible
diferenciarlos debido a que la naringenina posee un máximo de absorción a 289
nm, mientras que la chalcona posee un máximo de absorción a 366 nm. Asimismo,
se observaron rupturas características de aglicones de flavonoides (CO2,
H2O, C2H2O, etc.) que colaboraron en la
identificación de algunos de los compuestos econtrados (20, 21, 22, etc.).
En conclusión, cabe destacar que la
utilización de una doble detección acoplada a la cromatografía líquida
(HPLC-DAD-MS/MS) permitió realizar la identificación de subfamilias de flavonoides
presentes en diferentes alimentos con potenciales propiedades nutracéuticas, la
cual puede ser extendida a otras matrices alimenticias.