POSBIÓTICOS, UNA ALTERNATIVA COMO POTENCIALES BIOCONSERVANTES.

DÍAZ, MYRIAM ANABEL; VEGA-HISSI, ESTEBAN GABRIEL; ALBERTO M. R.; ARENA M.E.

Ciudad Autonoma de Bs As

Taller; Segundo Taller Biotecnología aplicada a la Tecnología de Alimentos; 2022

UTN

La mayoría de los antimicrobianos o conservantes de alimentos disponibles se evalúan contra microorganismos en el modo de vida planctónico (de vida libre). En consecuencia, estos tratamientos suelen ser ineficaces contra los biofilms, que pueden ser hasta mil veces más tolerantes a los tratamientos antimicrobianos. Por lo tanto, se requieren con urgencia nuevas estrategias para la prevención, dispersión y tratamiento de biofilms bacterianos.Un nuevo enfoque terapéutico ha propuesto un ataque indirecto a las bacterias, interfiriendo con su sistema de comunicación, también conocido como Quorum sensing (QS). La comunicación microbiana coordina la formación de biofilm y varios factores de virulencia y patogenicidad. Por lo tanto, los inhibidores de QS podrían ser una herramienta interesante para controlar al patógeno. La búsqueda de inhibidores de QS, se realiza en distintas matrices, buscando preferentemente productos naturales, los cuales puedan ser usados como conservantes en alimentos o como medicamentos. Una alternativa sería el uso de posbióticos, también conocidos como metabióticos, biogénicos o simplemente como metabólitos o sobrenadantes libres de células (SLC) pueden definirse como productos bacterianos no viables o subproductos metabólicos de microorganismos probióticos que tienen actividad biológica en el hospedador. Entre las propiedades funcionales de los posbióticos se encuentran propiedades antioxidantes, antimicrobianas e inmunomodulatorias. Al tener una amplia propiedad inhibitoria frente a los microorganismos, estos podrían utilizarse como una alternativa a los antibióticos (Kumar Tomar y col., 2015)En general, los posbióticos incluyen subproductos metabólicos bacterianos de características polares como bacteriocinas, etanol, diacetilo, acetaldehídos, enzimas, vitaminas y peróxido de hidrógeno. Pero casi no existen estudios sobre los metabolitos de mediana polaridad, por eso nos focalizaremos en ese rango de polaridadesEste trabajo, tiene como objetivo investigar si los Extractos Clorofórmicos obtenidos a partir del sobrenadante de bacterias probióticas de origen humano (Lacticaseibacillus casei CRL 431 y Lact. acidophilus CRL 730) denominados ECLc y ECLa, respectivamente, pueden actuar sobre el sistema de QS y los factores de virulencia controlados por QS.Estudiaremos como modelo de bacterias Gram positivas, cepas de Staphylococcus aureus, dado que este microorganismo es la bacteria más encontrada en los biofilms contaminantes en superficies que generalmente están en contacto con alimentos, incluso en acero inoxidable (Rodrigues y col., 2018). Investigaremos si los extractos pueden interferir con el crecimiento bacteriano, la formación y disrupción del biofilm, actividad metabólica de células en biofilm, la producción de los factores de virulencia, coagulasa y α-hemolisina. Usaremos como modelo de Gram negativas, cepas Pseudomonas aeruginosa, dado que sus biofilm son problemáticos en muchos sectores de la industria alimentaria, como cervecerías, lecherías, o fábricas de procesamiento de carne roja y de aves, causando enfermedades que se transmiten por los alimentos, así como el deterioro de los mismos. Evaluaremos el efecto de los extractos en el crecimiento bacteriano, la formación y disrupción del biofilm, actividad metabólica de células en biofilm, la producción de moléculas sintetizadas por las mismas bacterias para inducir el QS (autoinductores de QS) y de los factores de virulencia piocianina y elastasa. Para indagar un posible mecanismo de acción de los posbióticos sobre bacterias Gram negativas, usaremos una cepa mutante y biosensora, Chromobacterium violaceum CV026, incapaz de producir las moléculas autoinductoras de QS (aquellas que al alcanzar un umbral activan los factores de virulencia), pero que responde a la adición exógena de autoinductores formado el pigmento tóxico violaceína. Con el objetivo de buscar las moléculas responsables de las actividades biológicas estudiadas, determinaremos la composición química de los extractos, mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (CG-EM). Las estructuras encontradas serán evaluadas in silico con pruebas de acoplamiento molecular con las proteínas LasR y RhlR (receptores QS de P. aeruginosa) y SarA y AgrA (receptores QS de S. aureus) para ver si pueden ser las responsables de los efectos que se encuentren.Los resultados de este estudio muestran que ninguno de los extractos inhibió el crecimiento de las bacterias en estudio. Sin embargo, sobre ambos modelos bacterianos fueron capaces de reducir la formación de biofilm, disminuir actividad metabólica y producir una disrupción del mismo e inhibir parcialmente factores de virulencia.Los extractos ECLc y ECLa tienen un potencial significativo para inhibir la formación de biofilm en cepas de S. aureus a concentraciones de 10 y 100 µg/mL. En la etapa inicial de formación del biofilm, que es la adhesión a la superficie, (3 horas de incubación) se alcanza un inhibición de hasta un 75% en algunas cepas a ambas concentraciones. El biofilm maduro de 24 horas se vio disminuido en un rango de 20 al 40% para todas las cepas a 100 µg/mL.Un ensayo de vital importancia cuando ya se ha producido el proceso infectivo, es determinar si los compuestos o extractos ensayados pueden disrumpir el biofilm, o volver a las células del biofilm inactivas metabólicamente. ECLc rompe el biofilm maduro de S. aureus en un rango de 33-43 % y ECLa lo hace en un rango de 26-40%. Ambos extractos inhiben el metabolismo bacteriano en 2 de las 3 cepas ensayadas en un rango de 40 y 58%.ECLc y ECLa disminuyeron la actividad de hemolisina de las cepas S. aureus ATCC 6538, LVP 90 y LVP95 en un rango de 42 al 67% a la mayor concentración usada. Ambos extractos retardan la formación de coágulos de plasma en comparación con un control.En cuanto a los efectos en P. aeruginosa, ECLc y ECLa tienen un potencial significativo para inhibir la formación de biofilm en cepas de P. aeruginosa, a diferentes tiempos de incubación (3, 6 y 24 h) a concentraciones de 100 y 500 µg/mL con rango de disminución de 38-55% a la máxima concentración en un biofilm maduro.El potencial de ECLc y ECLa para alterar el biofilm previamente formado durante 24 horas de P. aeruginosa varía entre 20 y 40%. Los efectos sobre la sobrevida o metabolismo bacteriano en un biofilm maduro, estuvieron en rango de 27 al 38% para las cepas de P. aeruginosa PAO1 y LVP 60. Sin embargo para la cepa P. aeruginosa PA14 ambos extractos sólo lograron una ligera inhibición (11%). Cabe destacar que el antibiótico ciprofloxacina, sólo disminuyó la viabilidad celular en el biofilm, pero no pudo disrrumpirlo. Esto indica un gran potencial de los posbióticos para eliminar una contaminación ya establecida.Por otra parte, ambos extractos disminuyeron la actividad de la enzima elastasa entre 24 y 63%, en el rango de concentraciones entre 0,1 y 1 mg/mL. En el mismo rango de concentraciones, la inhibición de la producción del pigmento toxico piocianina disminuyo hasta un 77%.El hecho que no disminuya el crecimiento bacteriano, pero si el biofilm y los factores de virulencias controlados por QS, nos llevan a investigar el efecto de los extractos en la producción de autoinductores y la inhibición competitiva con los autoinductores de QS.En C. violaceum Tn5-mutante CV026, la producción de violaceína depende de la adición exógena del autoinductor de QS de bacterias Gram negativas, acil homoserina lactona (AHL). En un ensayo directo se adicionan AHL en el medio de cultivos y los extractos en pocillos. La inhibición del pigmento violaceína alrededor de los pocillos indica una inhibición competitiva en los sitios activos que inducen la producción violaceína. Los resultados indican que los compuestos presentes en ECLa y ECLc son inhibidores competitivos.Por otra parte, se incuban durante 24 h las tres cepas de P. aeruginosa en presencia de 100 y 500 µg/mL de ECLc y ECLa, y en ausencia de los mismos. Los sobrenadantes obtenidos se ponen en contacto con la cepa C. violaceum Tn5-mutante CV026. Si durante la incubación se sintetizaron cantidades suficientes de AHL se origina violaceína. En los medios controles sin los extractos se evidencia la producción de violaceína. Sin embargo, en presencia de ambos extractos, ninguna de las 3 cepas estudiadas formó la cantidad necesaria de AHL para inducir la producción de violencia en la cepa reportera. Estos resultados indican que los compuestos presentes en los extractos clorofórmicos pueden impedir la producción de inductores de QS en las cepas de P. aeruginosa estudiadas.El estudio químico de los extractos por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa, permitió identificar nueve y diez compuestos en los extractos ECLc y ECLa, respectivamente. Los principales compuestos bioactivos detectados en ambos extractos fueron cuatro 2,5-dicetopiperacinas: ciclo-Pro-Gly, ciclo-Leu-Pro, ciclo-Leu-Leu y ciclo-Phe-Pro.Para corroborar la hipótesis que estos compuestos podrían inhibir los sistemas de QS en Gram positivas y Gram negativas, se estudió el acoplamiento molecular in silico. Se utilizó el programa Autodock 4.1 para realizar los estudios de acoplamiento molecular de las 2,5-dicetopiperacinas con dos proteínas de S. aureus, SarA y ArgA, cuyas estructuras se descargaron de la base de datos PDB con los códigos de identificación 2FNP y 3BS1, respectivamente. Se realizaron dos tipos de cálculos de acoplamiento: un acoplamiento ciego y uno regular. La estructura molecular de los ocho derivados de 2,5-dicetopiperacinas y los ligandos naturales presentados en este estudio se recuperaron de la base de datos PubChem ( Kim y col., 2021). Las 2,5-dicetopiperacinas presentaron preferencia por dos sitios de unión a la proteína SarA: a) Los motivos de unión al ADN que involucra la región hélice-giro-hélice y la región de la horquilla β y b) El bolsillo de unión a cationes divalentes. Las dicetopiperazinas presentaron capacidad de interaccionar con distintos dominios proteicos de los receptores SarA y AgrA del QS de S. aureus, en sitios necesarios para que dichas proteínas cumplan con su función, pudiendo evitar de esa manera la unión al ADN o la asociación en múltiples homodímeros activos.Para los receptores de autoinductores de QS en P. aeruginosa, a estructura tridimensional de la proteína LasR (ID: 2UV0) se recuperó del banco de datos de proteínas (PDB) y se envió al servidor PDB2PQR que agregó los átomos pesados y de hidrógeno que faltaban, además de los estados de protonación asignados de acuerdo con un pH de 7,4.Como la estructura 3D de la proteína RhlR sigue sin resolverse, su secuencia de aminoácidos se obtuvo de la base de datos UniProt (depositada con el ID: P54292.1) y se generó un modelo in silico utilizando el servidor web ROBETTA (http: //robetta. bakerlab. org). La estructura resultante fue validada por PROCHECK. Los autoinductores naturales, 3-oxo-C12- HSL y C4-HSL, se utilizaron como modelos de referencia y se acoplaron a los sitios de unión de autoinductores en P. aeruginosa: LasR y RhlR respectivamente. Los dipéptidos cíclicos mostraron en los ensayos in silico capacidad de interaccionar con los sitios activos a los que se unen los ligandos naturales (autoinductores de QS) de los receptores LasR (3-oxo-dodecanoil-homoserina lactona) y RhlR (butanoil homoserina lactona) de los sistemas de QS de P. aeruginosa.Como conclusión podemos decir que los extractos clorofórmicos de sobrenadantes de bacterias lácticas estudiados, ricos en dipéptidos cíclicos, representan una fuente innovadora de compuestos anti-QS con interesantes propiedades antipatogénicas tanto para bacterias Gram positivas como Gram negativas. La buena correlación en la disminución del biofilm, su ruptura una vez formado, la disminución de los factores de virulencia, la producción de autoinductores de QS y los estudios in silico demostrados en este trabajo, nos impulsan a investigar un potencial uso de sobrenadantes de bacterias probioticas humanas como conservantes naturales de alimentos.REFERENCIASKim, S., Chen, J., Cheng, T., Gindulyte, A., He, J., He, S., Li, Q., Shoemaker, B. A., Thiessen, P. A., Yu, B., Zaslavsky, L., Zhang, J., y Bolton, E. E. (2021). PubChem in 2021: New data content and improved web interfaces. Nucleic Acids Research, 49(D1), D1388–D1395. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa971Kumar Tomar, S., Anand, S., Sharma, P., Sangwan, V., y Mandal, S. (2015). Role of probiotics, prebiotics, synbiotics and postbiotics in inhibition of pathogens.Rodrigues, J. B. dos S., Souza, N. T. de, Scarano, J. O. A., Sousa, J. M. de, Lira, M. C., Figueiredo, R. C. B. Q. de, de Souza, E. L., y Magnani, M. (2018). Efficacy of using oregano essential oil and carvacrol to remove young and mature Staphylococcus aureus biofilms on food-contact surfaces of stainless steel. Lwt, 93, 293–299. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.03.052.