Validación de una técnica de PCR multiplex para el diagnóstico de Escherichia coli productor de toxina Shiga basado en la deteccion de los genes stx1, stx2 y rfbO157.

LEOTTA G.A., ; EPSZTEYN S., ; CHINEN I., ; MILIWEBSKY E., ; MELAMED C., ; MOTTER M., ; FERRER M., ; MAREY E., ; RIVAS M.

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XVII Congreso Latinoamericano de Microbiología. X Congreso Argentino de Microbiología.; 2004

Asociación Argentina de Microbiología

La infección por Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es causa de diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). En Argentina el SUH es endémico y constituye la primera causa pediátrica de insuficiencia renal. E. coli O157:H7 es el prototipo de un grupo de más de 150 serotipos de STEC que comparten el mismo potencial patogénico. Considerando que distintos serotipos de E. coli son capaces de sintetizar toxinas Shiga y que la dosis infectiva es de 10 a 100 unidades formadoras de colonias (UFC), se requiere la implementación de técnicas altamente sensibles y capaces de detectar bajas concentraciones de STEC. La selección de métodos de diagnóstico se fundamenta en un balance entre rapidez, selectividad y costo. La PCR multiplex es una técnica cualitativa cuyos resultados se expresan como presencia o ausencia de señal. El objetivo del presente trabajo fue validar ?in house? una técnica de PCR multiplex para el diagnóstico de STEC basado en la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157, en dos laboratorios independientes, en forma paralela. Se utilizaron 52 cepas STEC y 30 cepas no-STEC. Se compararon dos técnicas de extracción de ADN: buffer tritón y un kit comercial. Se determinaron los siguientes parámetros: a) Rango de trabajo (límite de detección y límite de corte) con 8 cepas, b) Selectividad (inclusividad y exclusividad) con 82 cepas en una concentración de 1 x 105 UFC/50µl, c) Robustez, con 5 cepas en una concentración de 1 x 105 UFC/50µl. Finalmente, se evaluó el desempeño de la técnica al combinar distintas concentraciones de dos cepas con diferentes factores de virulencia. Para el análisis probabilístico de los resultados se utilizó una tabla de contingencia y los resultados se compararon con los obtenidos por citotoxicidad en células Vero (Gold Standard) y serotipificación. La extracción de ADN con buffer tritón permitió detectar los genes stx1, stx2 y rfbO157 en concentraciones inferiores en 2 logaritmos a las obtenidas con el kit comercial. El rango de trabajo dependió de la cepa analizada, los valores máximos y mínimos fueron 6.6 x 107 y 1 x 104 UFC/50µl. El límite de detección fue de 1 x 104 UFC/50µl y el límite de corte fue de 1x 105 UFC/50 l para todas las cepas analizadas. La robustez fue óptima en 6 repeticiones, 3 días consecutivos, con diferentes termocicladores y distintos operadores. Se obtuvo 100% de inclusividad, 100% de exclusividad, 100% de predicción positiva, 100% de predicción negativa y 100% de precisión analítica. No se observó interferencia al combinar diferentes factores de virulencia en distintas concentraciones. Todos los resultados fueron similares en los dos laboratorios participantes. Teniendo en cuenta que en Argentina la frecuencia de detección de STEC no-O157 en casos de SUH es aproximadamente del 30%, la PCR multiplex validada es una técnica apropiada para la detección de STEC O157 y no-O157; en muestras clínicas luego de un primoaislamiento, y en muestras de alimentos luego de un preenriquecimiento en caldo selectivo y posterior aislamiento.