Valoración in vitro de sustancias bioactivas del metabolismo de lactobacilos probióticos como agentes antibiofilm de Streptococcus agalactiae de origen clínico

RUIZ, FRANCISCO; NARDI, MARÍA; ASURMENDI, PAULA; GARCÍA, MARÍA JOSÉ; PASCUAL, LILIANA; BARBERIS, LUCILA

Rosario

Congreso; XIII Congreso Latinoamericano de Microbiología, XIII Congreso Argentina de Microbiología.; 2016

Asociación Argentina de Microbiología

Los objetivos de este trabajo fueron i) estimar la capacidad de inhibición de formación de biofilm de cepas de Streptococcus agalactiae (SGB) de origen  clínico  por  las  sustancias  bioactivas  de  la  cepa  probiótica   Lactobacillus  rhamnosus  L60  GenBank  n°  EF  495247,  ii)  evaluar  el  efecto combinado de los biometabolitos de la cepa L60 y la cepa probiótica, Lactobacillus fermentum L23 GenBank n° GQ no.455406 sobre el biofilm estreptocócico. La cepa L60 produce en el sobrenadante libre de células (SLC) tres tipos de sustancias bioactivas: ácidos orgánicos (AOs), H2O2 y bacteriocina L60, mientras la cepa L23 sintetiza AOs y bacteriocina L23. Para obtener separadamente estas sustancias, se centrifugaron cultivos de lactobacilos y se extrajeron los SLCs L60 y L23 conteniendo el conjunto de sustancias bioactivas. Los SLCs se neutralizaron  (NaOH 1N) y se obtuvieron  los  SLCN  L60  (H2O2 +  bacteriocina  L60)  y  SLCN  L23  (bacteriocina  L23).  Así,  primero  se  probaron el  SLC  y SLCN  de  L60  y luego  se estudió el efecto combinado de los SLCN L60+L23 (1:1) sobre la formación de biofilm. Para los ensayos de formación e inhibición del biofilm de SGB se realizó una técnica cuantitativa en tubo con cristal violeta (CV) al 1%. Alícuotas de 200 µl de suspensiones de SGB (~ 3x108 ufc/ml) se incubaron  por  24  h  a  37°C  en  microaerobiosis.  Se  descartó  el  medio  y  se  tiño  el  biofilm  con  CV.  Se  extrajo  el  CV  y  se  midió  la  DO  por espectrofotometría  UV  (540  nm).  El  100%  de  las  cepas  de  SGB  (n=30)  produjeron  biofilm,  mostrando  en  el  86,67%  (26/30)  una  capacidad notable de formación de biofilm. Empleando el SLC L60 sobre el biofilm de estas cepas se evidenció una disminución promedio del 91,10% en comparación al biofilm de SGB sin tratamiento, siendo atribuido a la acción conjunta de AOs, H2O2 y bacteriocina L60. Al evaluar el efecto del SLCN L60 se halló una capacidad de inhibición de biofilm del 100% en el 53% de las cepas (16/30) y un valor promedio de reducción de biofilm del  97,3%  respecto al  cultivo  de SGB  sin  tratar. Dicho efecto inhibitorio  sobre el  biofilm  se debió a la acción  del H2O2 y la  bacteriocina  L60. Cuando se evaluó la combinación de los SLCN L60+L23 sobre la producción de biofilm de SGB se evidenció una inhibición mayor en relación a los SLCN L60 y L23 por separado. Si bien en el 40% de las cepas de SGB se observó una inhibición completa del biofilm, el 60% restante tuvo una reducción promedio mayor (98%) cuando se comparó con los SLCNs independientemente. La reducción del biofilm de SGB se debió a la acción del H2O2 y las bacteriocinas L60 y L23. En conclusión, los AOs, H2O2 y bacteriocina L60 de la cepa probiótica L60 constituyen una opción biológica para  inhibir  el  biofilm  de  SGB.  Asimismo,  el  aprovechamiento  del  H2O2  y  las  bacteriocinas  L60  y  L23  de  manera  combinada  incrementa  la capacidad  de inhibición y/o  reducción de  formación  del  biofilm estreptocócico  representando  una estrategia antibiofilm  potencialmente  útil para combatir las infecciones por S. agalactiae