Acción bioterapéutica de Lactobacillus fermentum y Lactobacillus rhamnosus sobre cepas de Neisseria gonorrhoeae

ASURMENDI, PAULA; RUIZ, FRANCISCO; GERBALDO, GISELA; PASCUAL, LILIANA; BARBERIS, LUCILA

Río Cuarto, Córdoba, Argentina

Jornada; VIII Edición de la Semana del microbiólogo; 2010

Asociación de Profesionales Microbiólogos de la República Argentina

La mujer durante la etapa reproductiva puede sufrir numerosas infecciones genitales, siendo una de ellas la gonorrea. El balance entre el mantenimiento de un estado saludable y la emergencia de una infección genital está controlado fundamentalmente por la presencia y la acción benéfica de los lactobacilos. La protección que los lactobacilos producen en vagina se basa fundamentalmente en dos mecanismos, la adherencia específica al epitelio vaginal de especies de Lactobacillus y la producción de metabolitos activos como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno (H2O2) y bacteriocinas. El objetivo de este trabajo fue evaluar y cuantificar la actividad inhibitoria dada por la producción de ácidos, H2O2 y bacteriocinas de las cepas de Lactobacillus fermentum y Lactobacillus rhamnosus aisladas del tracto genital femenino sobre diferentes cepas de Neisseria gonorrhoeae. Para la obtención de sobrenadante libre de células de Lactobacillus fermentum y Lactobacillus rhamnosus, a partir de un cultivo de L. fermentum y L. rhamnosus en MRS agar, se inoculó una ansada en 2 ml de caldo MRS, se lo incubó 18 h a 37º C en atmosfera húmeda y en microaerofília (5% CO2). Luego se colocó 0,5 ml del cultivo en 9,5 ml de caldo MRS (5% v/v), y se incubó en las mismas condiciones. Para la obtención del sobrenadante libre de células se centrifugó los cultivos a 8.500 rpm a 4º C, durante 20 min. El sobrenadante libre de células obtenido se fraccionó en tubos estériles y se expuso luego a vapores de cloroformo durante 20 min y fue refrigerado a 4º C hasta el momento de su uso. Para la actividad inhibitoria de ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas producidos por lactobacilos sobre Neisseria gonorrhoeae se siguió el ensayo de difusión en pozo. Los sobrenadantes libres de células de cada cepa de lactobacilo obtenidos en el punto anterior fueron neutralizados con hidróxido de sodio 1N, hasta alcanzar un pH de 6, eliminando así el efecto inhibitorio de los ácidos producidos por los lactobacilos. En el caso de L. fermentum con este único tratamiento se pudo ver la actividad bacteriocidal, pero para L. rhamnosus se eliminó además el peróxido de hidrógeno que contenía el sobrenadante L60, con el agregado de peroxidasa (0,1 mg/ml). Para evidenciar la actividad de estas sustancias, se sembró en varias direcciones una placa de Thayer ? Martin con hisopo de dacron conteniendo la cepa de gonococo aislada previamente en placa de agar chocolate, se realizaron los pozos y fueron inoculados con 100 µl de cada uno de los tratamientos de los sobrenadantes libres de células. Para L. fermentum un pozo correspondió al sobrenadante libre de células (actividad inhibitoria dada por ácidos y bacteriocinas) y el segundo al sobrenadante libre de células neutralizado (actividad bacteriocidal); en el caso de L. rhamnosus un pozo correspondió al sobrenadante libre de células (actividad inhibitoria dada por ácidos, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas), el segundo al sobrenadante libre de células neutralizado (actividad inhibitoria dada por peróxido de hidrógeno y bacteriocinas) y tercer y último pozo correspondió al sobrenadante libre de células neutralizado y tratado con peroxidasa (actividad inhibitoria dada por bacteriocinas). Se incubó en atmosfera húmeda a 37º C por 18 a 24h en microaerofília (5% CO2) y se midieron las zonas de inhibición de crecimiento de la cepa de N. gonorrhoeae. El control positivo se realizó mediante la técnica de estrías cruzadas utilizando Escherichia coli como cepa sensible. Para la determinación de la concentración inhibitoria mínima de las bacteriocinas de Lactobacillus fermentum y Lactobacillus rhamnosus sobre Neisseria gonorrhoeae, se realizaron diluciones al medio hasta 1/128 del SLC luego de ser neutralizado y tratado con peroxidasa (en el caso de L. rhamnosus). Se colocó 0.1ml de cada dilución en los respectivos pozos. Para el estudios de interacciones entre las bacteriocinas producidas por cepas de lactobacilos sobre N. gonorrhoeae, se sembró la superficie de placas de agar Thayer- Martin, con la cepa de gonococo. Se hicieron 2 pozos en el agar separados por una distancia relacionada al tamaño de los halos de inhibición del crecimiento. Cada uno de los pozos fueron inoculados con 0.1 ml del SLC tratados de ambos lactobacilos y se incubaron en microaerobiosis durante 24h a 37º C . El 100% de las cepas de N. gonorrhoeae estudiadas fueron sensibles a la acción de los SLC de L. fermentum y L. rhamnosus, los mismos resultados fueron obtenidos con el SLC neutralizado y tratado con peroxidasa. De los metabolitos sintetizados por las dos cepas de lactobacilos estudiadas la mayor actividad inhibitoria hallada en el 100% de las cepas de N. gonorrhoeae fue dada por el efecto de las bacteriocinas. De los estudios de interacción se halló que el 100% de las cepas de N. gonorrhoeae estudiadas presentaron sinergismo entre las bacteriocinas producidas por L. fermentum y L. rhamnosus. Es de destacar que ambas bacteriocinas inhiben el crecimiento del microorganismo patógeno aun diluída.