Diferenciación de poligalacturonasas a través de un método colorimétrico

TORRES SEBASTIÁN; SAYAGO JORGE E.; ORDOÑEZ ROXANA M.; ISLA MARÍA INÉS

Tafí del Valle

Jornada; XXVII JORNADAS CIENTIFICAS de las Asociación de Biología de Tucumán; 2010

Introducción: Las poligalacturonasas (PGasas) son enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza que catalizan la hidrólisis del ácido poligalacturónico (APG). Existen dos clases, las endo-PGasas que hidrolizan el polímero de APG a través de un mecanismo de ataque al azar, produciendo cadenas más pequeñas, y las exo-PGasas que lo hacen a través de un mecanismo terminal de ataque, liberando dímeros o monómeros de ácido galacturónico. Actualmente los métodos usados para determinar la actividad PGasa se basan principalmente en la medición de los extremos reductores liberados tras la hidrólisis del APG. Sin embargo, estas técnicas no permiten distinguir entre los dos tipos de PGasas. Objetivo: Desarrollar un método para cuantificar la actividad PGasa, que permita diferenciar las actividades endo- y exo-PGasa. Metodología: Las actividades endo-PGasa de Geotrichum candidum y exo-PGasa de zanahoria (Daucus carota) fueron determinadas por cuantificación del APG (métodos de Somogyi-Nelson y del Rojo de Rutenio [RR]). Método del RR: la mezcla de reacción fue llevada a 3 ml con agua destilada (AD), adicionada con 40 μl de RR 0,5% (p/v), llevada a 6 ml finales con AD y centrifugada a 1000 xg (5 min); la absorbancia del sobrenadante fue leída a 535 nm. Resultados: Este nuevo método se fundamenta en la determinación espectrofotométrica del colorante RR. El colorante interacciona con el APG y causa su precipitación. En presencia de una endo-PGasa el APG es hidrolizado a fragmentos de menor tamaño, que no pueden ser precipitados al interaccionar con el RR, causando un incremento de colorante en el sobrenadante. La medición fotocolorimétrica del exceso de RR en el sobrenadante permite determinar la actividad endo-PGasa en términos de velocidad inicial. Sin embargo, el mecanismo y la cinética de hidrólisis del APG por exo-PGasas no hacen posible determinar la actividad de las mismas en términos de velocidad inicial por este método, lo que permite diferenciar estas dos actividades hidrolíticas. Conclusión: el método del RR representa una alternativa rápida y sencilla para discriminar y cuantificar la actividad endo-PGasa.