Adsorción de fagos temperados sobre cepas de Lactobacillus delbrueckii y fago resistencia ligada a heterogeneidad morfológica (Póster)

TRUCCO, V.; BINETTI, A.; REINHEIMER, J.; QUIBERONI, A.; SUÁREZ, V.

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología, VI Congreso de Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica y I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

INTRODUCCIÓN: Los fagos temperados perturban el normal proceso de fermentación superando la inmunidad lisogénica de la cepa que lo liberó, atacándola, o encontrando otras cepas sensibles constituyentes del fermento utilizado. Por otra parte, la heterogeneidad morfológica en cultivos puros, particularmente de Lactobacillus delbrueckii, es bien conocida, pero no existen reportes que relacionen esta diversidad morfológica con la fago resistencia en mutantes con buenas propiedades tecnológicas.OBJETIVOS: Estudiar la etapa de adsorción de dos fagos temperados (Cb1/204 y Cb1/342) de L. delbrueckii, en relación a distintas variables. Aislar mutantes con buenas propiedades tecnológicas y relacionarlos con variantes morfológicas obtenidas para cada cepa sensible.MATERIALES Y MÉTODOSCaracterización de la Adsorción:Influencia del ión Ca2+: cultivos activos de las cepas se llevaron hasta una DO 560nm aprox. 0.5, centrifugando y resuspendiendo el pellet en la mitad del volumen original. La suspensión se realizó en Caldo MRS, con y sin el agregado de Ca2+ (10mM). Las células se infectaron con el fago (m.o.i  0.02) y se incubaron a 37°C. Se graficaron las cinéticas de adsorción para cada caso.Influencia del pH: los pellets se suspendieron en Caldo MRS-Ca llevado a diferentes valores de pH (3, 4, 5, 6, 7 y 8). Las tasas de adsorción se midieron a los 30 min.Influencia de la temperatura: Los pellets se suspendieron en Caldo MRS-Ca y se incubaron a distintas temperaturas (0, 10, 20 30 y 40 °C). Las tasas de adsorción se midieron a los 30 min.Influencia del estado fisiológico celular: Idem a), utilizando células viables y no viables, estas últimas obtenidas sometiéndolas 10 min a 100 °C. Se graficaron las cinéticas de adsorción para cada caso.Mutantes fago resistentes y variantes morfológicas:Se aislaron variantes morfológicas de ambas cepas sensibles, obteniéndolas de Agar MRS. Se obtuvieron mutantes fago resistentes utilizando el método del cultivo secundario. A los mutantes estables (resistentes hasta 7 repiques en presencia de alta concentración del fago) se les estudió la actividad acidificante (pH en LDR 10%, 24h a 37°C) y proteolítica (OPA Test).RESULTADOS: La influencia del ión calcio dependió del fago estudiado ya que Cb1/204 no necesitó de este ión en esta etapa del ciclo lítico, mientras que Cb1/342 si. Ambos fagos resistieron bien los pHs ácidos (hasta 3), pero no los alcalinos (pH 8). El proceso de adsorción de ambos fagos dependió de la temperatura de incubación, y los valores máximos se observaron entre 30 y 40 °C (85-99%). La viabilidad celular modificó el nivel de adsorción solamente para el fago Cb1/342 (menor para células no viables).Para cada variante morfológica obtenida (dos para cada cepa sensible), se logró obtener un 100% de mutantes fago resistentes verdaderos. Algunos presentaron muy buenas propiedades tecnológicas (a veces mejorando las de la cepa madre) y se los pudo correlacionar siempre con una de las variantes morfológicas encontradas.CONCLUSIONESSe caracterizó la etapa de adsorción de los primeros fagos temperados de L. delbrueckii aislados en el país. Se logró aislar mutantes fago resistentes con buenas propiedades tecnológicas, en elevada proporción. Se relacionaron estos mutantes con las variantes morfológicas encontradas en las cepas sensibles.