Análisis de la microbiota del ciego de pollos parrilleros suplementados con probióticos por DGGE

BLAJMAN J.E.; BERISVIL, A.P.; CONTI, G.B.; ASTESANA, D.M.; ROMERO SCHARPEN, A.; ROSSLER, E.; SOTO, L.P.; MARTI, L.E.; FRIZZO, L.S.

Santa Fe de la Veracruz

Congreso; XVI Jornadas Argentinas de Microbiología - III Congreso Bioquímico del Litoral; 2015

Asociación Argentina de Microbiología

La electroforesis en gelcon gradiente desnaturalizante (DGGE) es una técnica molecular utilizada paraidentificar microorganismos dominantes en comunidades microbianas complejas. La técnica se basa en la migración de fragmentos de ADN a través de geles de poliacrilamidaque contienen concentraciones crecientes de agentes desnaturalizantes. El objetivo de este ensayo fue analizarla dinámica poblacional de la microbiota del ciego de pollos parrillerostratados durante 16 días con la cepa potencialmente probiótica Lactobacillussalivarius DSPV 001P mediante DGGE. Se emplearon 96 pollos parrilleros de 1día de vida, divididos en tres réplicas de 32 pollos. La cepa fue suministradacon la dieta en una dosis de 1x1010UFC/pollo durante 9 d y 1x109 UFC/pollo durante los 7 drestantes. Al día 0, 15, 30 y 45 de la crianza, seis pollos tomados al azar(dos por réplica) fueron sacrificados por dislocación cervical. Una fracción de0,2 g de ciego de cada pollo fue utilizada para la extracción de ADN y amplificaciónpor PCR empleando los primers universales GC-HDA1 yHDA2 que amplifican la región V2-V3 del gen del ARNr 16S. Los productos de PCR se sembraron en geles de poliacrilamida 8 % p/v entampón Tris, ácido acético, EDTA (TAE) y la separación óptima se alcanzó congradientes desnaturalizantes urea-formamida 40-55%. En cada extremo de los geles se sembró un patrón constituido por los productosde PCR de las siguientes cepas: wild-type Enterococcusfaecium, wild-type L. salivarius DSPV 001P, wild-type Campylobacter jejuni C173 ywild-type Salmonella enteritidis 421. Laelectroforesis se llevó a cabo a voltaje constante 130 V durante 4 h a 60 °C.Los geles se tiñeron con SYBR® Safe y se visualizaron en un transiluminador. Lasimilitud entre perfiles se calculó mediante el método agrupamiento pareado no ponderado utilizando media aritmética (UPGMA) empleando elprograma BioNumerics, presentándose los resultados en forma de dendrograma. Losperfiles DGGE arrojaron patrones compuestos por 5 a 16 bandas dependiendo de lamuestra  analizada. Un total de 35 bandas fueron escindidas y enviadas a secuenciar,obteniéndose entre 83% y 100% de similitud con las secuencias ADNr 16Sdisponibles en el GenBank. Ocho fragmentos de ADN se relacionaron consecuencias de bacterias no cultivables, 10 con secuencias de bacterias cultivablesy 18 compartieron igual porcentaje de identidad con bacterias cultivables y nocultivables. Cepas pertenecientes a los géneros Clostridium, Enterococcus,Lactobacillus y Escherichia fueron identificadas. Además, algunos fragmentos alinearoncon especies de los géneros Shigella,Hespellia, Robinsonella, Blautia, Ruminococcus, Streptococcus y Alistipes. Al día 45, fue posibleencontrar bandas coincidentes con la cepa de referencia. La secuenciación de dichas bandas alineó con L. salivarius. Enconclusión, DGGE permitió analizar simultáneamente numerosas muestras, así comoevaluar las diferencias y similitudes existentes entre ellas. A su vez, latécnica posibilitó identificar y comparar a lo largo del tiempo la microbiotadominante del ciego de pollos parrilleros que habían recibido la cepapotencialmente probiótica L. salivarius DSPV 001P.