Monitoreo de Lactococcus lactis durante su tránsito en el tracto intestinal de ratones utilizando una técnica fluorescente

MARELLI, B.; FRIZZO, L.; ROSMINI, M.R.

Casilda, Santa Fe

Jornada; X Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2009; 2009

Facultad de Ciencias Veterinarias-Universidad Nacional de Rosario

Es fundamental que las bacterias del ácido láctico (BAL) mantengan su viabilidad y la estabilidad de sus propiedades tecnológicas más relevantes durante todo el proceso de elaboración, almacenamiento, y distribución de un producto alimenticio 1,2. En el caso particular de las cepas probióticas además, deben permanecer metabólicamente activas luego del consumo y durante el tránsito en el tracto gastrointestinal. Esto significa que dichas bacterias deben ser capaces de sobrevivir a las condiciones acídicas del estómago y ser resistentes a la degradación por las enzimas hidrolíticas y las sales biliares en el intestino delgado. Sin embargo, se conoce muy poco acerca del destino de estos microorganismos dentro del ambiente complejo de la flora microbiana y el estudio de la distribución de estas bacterias in vivo representa un gran desafío. Con frecuencia, el recuento en placa es utilizado como un método estándar para evaluar la viabilidad de las bacterias a partir de diferentes muestras de tejidos. No obstante, las poblaciones bacterianas que han estado expuestas a estrés pueden entrar en un estado de no-cultivables manteniendo aún la actividad 3. Como alternativa, las tinciones fluorescentes basadas en la fijación inespecífica de un fluorocromo a algún componente del microorganismo, en combinación con las técnicas de microscopia de fluorescencia ofrecen una herramienta poderosa para la localización y el seguimiento de una bacteria durante su tránsito en el tracto gastrointestinal. A diferencia de los genes reporteros fluorescentes o bioluminiscentes, los fluorocromos como el FITC (isotiocianato de fluoresceína) pueden ser detectados directamente en matrices complejas sin el agregado de sustratos específicos o cromogénicos y no se requiere una extracción previa o un plaqueo de las bacterias. En este contexto, el objetivo del presente trabajo ha sido realizar un seguimiento de Lactococcus lactis teñidos con FITC durante su tránsito en el tracto intestinal de ratones Balb/c, como modelo animal experimental. Si bien no existe un consenso claro acerca de si la BAL utilizada para la puesta a punto de esta técnica presenta propiedades probióticas ha sido seleccionado debido a la facilidad de manipulación que ofrece esta bacteria. Luego, los resultados obtenidos podrián ser extrapolados a otras cepas bacterianas. Como primer paso del ensayo se realizó un cultivo de la bacteria L. latis en M17-glucosa hasta fase exponencial. Seguidamente, este cultivo fue centrifugado y el pellet de bacterias fue lavado dos veces con buffer PBS y resuspendido en el mismo buffer con FITC (100 mg/ml) durante 1 h a 37°C en oscuridad. Las bacterias marcadas fueron lavadas 4 veces con PBS para eliminar el exceso del colorante FITC no unido. Las bacterias marcadas fueron resuspendidas en PBS a una concentración de 108 células/ml y se administraron 0.2 ml a cada animal utilizando una sonda intragástrica. Seguido de la administración oral de una dosis de L. lactis, el pasaje fue monitoreado por microscopia de fluorescencia en secciones histológicas. Para ello, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical a los 10 y 20 min posteriores a la administración del inóculo. El intestino de cada animal fue removido y diferentes secciones del tejido fueron incluidas en medio de inclusión para crióstato y congelados a -80°C hasta el momento de su utilización. Los cortes histológicos fueron obtenidos mediante un crióstato y examinados utilizando un microscopio de luz fluorescente. De esta manera fue posible detectar bacterias fluorescentes en la luz intestinal de los cortes histológicos obtenidos a partir de los animales sacrificados tanto a los 10 min como a los 20 min luego de la administración del inóculo bacteriano. Estos resultados preliminares resultan alentadores en cuanto a la utilidad de la técnica de tinción con FITC para el seguimiento in vivo de un inóculo bacteriano.   BIBLIOGRAFÍA 1. Dunne, C.; O?Mahony, L.; Murphy, L.; Thornton, G.; Morrissey, D; O?Halloran, S.; Feeney, M.; Flynn, S.; Fitszgerald, G; et al. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Am. J. Clin. Nutr. 73: 386S-92S, 2001. 2. Tuomola, E.; Crittenden, R.; Playne, M.; Isolauri, E.; Salminen, S. Quality assurance criteria for probiotic bacteria. Am. J. Clin. Nutr. 73: 393S-8S, 2001. 3. Ben Amor, K.; Vaughan, E.; de Vos, W. Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria. J. Nutr. 137: 741S-7S, 2007.