Evaluación preliminar de la cepa m6c de Bacillus cereus como antagonista de Paenibacillus larvae, agente causal de la loque americana de las abejas

17.3.3. MINNAARD, J. & ALIPPI, A.M

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología, VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC)- I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA); 2010

Asociación Argentina de Microbiología

La enfermedad más grave de la etapa larval de las abejas (Apis mellifera) es la loque americana ocasionada por la bacteria esporulada Paenibacillus larvae. La misma tiene difusión mundial y en la Argentina está ampliamente diseminada en todas las zonas productoras de miel. El empleo de antibióticos para su control como alternativa a la quema de colmenas ha facilitado la aparición de cepas resistentes a oxitetraciclina y contaminación de las mieles con residuos de estas sustancias. Con el objeto de disponer de opciones de control no contaminantes para la enfermedad se planteó investigar el antagonismo entre especies bacterianas productoras de bacteriocinas y P. larvae.En nuestro laboratorio, se han encontrado cepas aeróbicas esporuladas aisladas de mieles capaces de inhibir el desarrollo de P. larvae en medios sólidos. Con este antecedente, se planteó el objetivo de caracterizar la o las sustancias antagónicas producidas por la cepa m6c de Bacillus cereus. Para ello se realizaron cultivos en fase estacionaria temprana de esta cepa en medio tripticasa soya a 32 °C en agitación. Luego se separaron las bacterias mediante centrifugación y se precipitaron las proteínas del sobrenadante filtrado con sulfato de amonio al 65 %. El precipitado obtenido luego de centrifugar se resuspendió en buffer fosfato (PBS) y se ultrafiltró en columnas Amicon® Ultra-15 de 3K concentrando las muestras 100 veces. Finalmente, se purificó mediante extracción con butanol (2:3) 1 h a T ambiente y el solvente se evaporó en rotavapor a 40 °C. La capacidad inhibitoria de las muestras se evaluó mediante la técnica del spot test utilizando como microorganismo indicador la cepa  P. larvae ATCC 9545 y se determinó la concentración de proteínas por el método de Bradford. Paralelamente se realizó el mismo procedimiento con medio de cultivo sin inocular como control. La muestra obtenida luego de la purificación con butanol resuspendida en PBS se trató con proteinasa K (1 mg/ml) durante 1 h a 37 °C. La actividad enzimática se inactivó por incubación a 100 °C durante 3 minutos. Los resultados demuestran que la sustancia inhibitoria produce un halo de inhibición de 18,7 ±  0,28mm de diámetro con una concentración de proteínas de 0,24 mg/ml. El procedimiento de purificación con butanol demostró que el 83 % de las proteínas quedan en la fase acuosa pero no poseen capacidad inhibitoria. En geles de SDS-PAGE de glicina se observaron bandas de 94 KDa, 20 KDa y una de aproximadamente 50 KDa. El tratamiento con proteinasa K no inhibió la capacidad inhibitoria de las muestras, arrojando halos de inhibición sin diferencias significativas (p < 0.05) con respecto a la muestra sin tratar (17,5 ± 0,85 mm). El control no produjo halos de inhibición. Los datos presentados demuestran que la cepa m6c de B. cereus produce una sustancia inhibitoria contra P. larvae que no sería de naturaleza proteica.