Extracción asistida por ultrasonido acoplada a HPLC-DAD, para la determinación de endocannabinoides en plasma

RAMIREZ, DANIELA; MARTÍN GIMENEZ, VIRNA; MANUCHA, WALTER; CAMARGO, ALEJANDRA

Congreso; 10° Congreso Argentino de Química Analítica; 2019

Los endocannabinoides (eCBs) son sustancias endógenas altamente apolares, de naturaleza lipídica derivadas del ácido araquidónico. Estos compuestos, particularmente la anandamida, desempeñan un papel importante en una amplia gama de procesos fisiológicos1. La evidencia de alteración (aumento o disminución) de los niveles de eCBs en una variedad de patologías ha alimentado el interés en la cuantificación precisa de estos lípidos en diversos tejidos y fluidos corporales tales como el plasma. Frente a esta situación, resulta esencial la utilización de metodologías robustas y sensibles para analizar estos mediadores lipídicos. En los últimos años, se han desarrollado varios métodos analíticos para determinar los niveles tisulares de anandamida. Muchos implican el uso de espectrometría de masas o derivatización con reactivos fluorogénicos para su medición empleando detectores fluorimétricos21?4. Si bien estos métodos son sensibles y robustos, implican equipamientos complejos y caros que no siempre están disponibles en laboratorios de análisis rutinarios. Dada la importancia de su cuantificación, es que surge el objetivo del presente trabajo: desarrollar una metodología analítica sencilla y asequible que pueda ser aplicada disponiendo de equipamiento de complejidad intermedia, en este caso mediante HPLC-DAD. A tal fin, la columna de elección fue una Columna Spherisorb (Waters), ODSC18, 25 cm las condiciones operacionales fueron optimizadas, arribando a las siguientes: gradiente isocrático, fase móvil acetonitrilo: ácido fórmico 0,1% (80:20) y flujo 1 mL/min. La longitud de onda seleccionada fue de 210 nm. Con estas condiciones se obtuvo un tiempo de retención del estándar de anandamida fue de 7,73 ±0.07 min. Se realizó una curva de calibrado obteniéndose un rango dinámico lineal hasta la concentración de 3000 ppm (r2 0,9999). Para la preparación de muestras, se procedió mediante centrifugación (14000 rpm) de sangre refrigerada, para separar el plasma. Para maximizar la extracción del analito de interés, se realizó una optimización univariada y los parámetros considerados fueron: tipo de solvente, volumen de solvente, tiempo de ultrasonido, temperatura. La combinación óptima de variables fue: la adición de 800 µL de acetonitrilo a 200 µL muestra y 5 min US, posterior centrifugación (14000 rpm, 5 min) y filtración (0,22 µm), previa inyección. Se evaluó el efecto de la matriz en la cuantificación y los resultados obtenidos no evidenciaron diferencias significativas en los tratamientos considerados. Con las condiciones mencionadas pudo hallarse un LOQ 0,8 y un LOD de 2,5 µg/mL. Se puede concluir que la metodología desarrollada reúne las condiciones analíticas de calidad para su empleo en múltiples aplicaciones.