“Primer approach por metagenómica de la biodiversidad fúngica de un viñedo de la región vitivinícola San Rafael-Mendoza

LONGHI, S.J.; MARTIN, M.C.; MORATA DE AMBROSINI, V.

Mendoza

Otro; Coloquio Internacional Innovaciones y mutaciones de los viñedos del mundo: pasado, presente y futuro?; 2023

Chaire UNESCO- FCA(UNCuyo)- FCAI(UNCuyo)- UMaza- UChilecito- UDon Bosco

La metagenómica es el estudio del DNA extraído directamente de un ecosistema, incluye el análisis conjunto de toda la comunidad sin la necesidad de cultivo previo ni de aislamiento de los individuos por separado. Prácticamente todos los campos de la biología están atravesados por los microorganismos, de manera que las aplicaciones de la metagenómica se extienden a los campos que van desde la agricultura, medicina, la bioenergía, hasta la vitivinicultura. La posibilidad, obtenida en los últimos años, de secuenciar en forma masiva grandes volúmenes de DNA ha permitido explorar las comunidades a un nivel que no tiene precedentes, de esa manera podemos explicar cómo los ambientes influyen en la composición de microorganismos presentes en un ecosistema, y recíprocamente cómo la composición de la comunidad influye sobre las funciones que ofrece el ecosistema. El objetivo del presente trabajo fue llevar a cabo un análisis metagenómico de la microbiota fúngica asociada a la superficie de las uvas de un viñedo localizado en Las Paredes, San Rafael, Mendoza (Argentina), el cual pertenece a la región vitivinícola DOC San Rafael, siendo este el primer reporte del microbioma de esta región.La biodiversidad fúngica fue estudiada mediante secuenciación masiva de amplicones ITS de muestras del DNA obtenido del lavado de la superficie de las uvas intactas tomadas del viñedo. La secuenciación se realizó mediante un ultrasecuenciador MiSeq de Illumina, en el marco del proyecto GEN00433, realizado por la Plataforma de Genómica y Bioinformática del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja (CIBIR), en Logroño, España. Se realizó un muestreo rectangular de dos sectores del viñedo. La toma de muestras se realizó en febrero de 2022 en el punto de maduración tecnológica de las uvas, con guantes y todos los cuidados para no contaminar la superficie de las uvas. Para llevar a cabo el experimento, se realizó el lavado de 80 granos de uvas con 80 mL de solución salina estéril y libre de DNA. Se realizaron 5 repeticiones por variedad de uva, más un “control blanco” de la solución salina estéril y un “blanco del kit de extracción del DNA” con agua miliQ estéril y libre de DNA. El tiempo de incubación fue de 2 horas en agitación (130 rpm) a 25ºC. Se realizó un posterior lavado de las uvas con 20 mL de solución salina por 5 min. La centrifugación para recoger el pellet de células fue de 10000x g (8000 rpm) por 10 min. Particularmente, se realizó la optimización del método de extracción del DNA mediante el kit QIAGEN Soil. Para corroborar la extracción del DNA se realizó el chequeo de la extracción y concentración del DNA mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Como principales resultados se encontró que la concentración de amplicones de las muestras de DNA de la superficie de las uvas es de 3,86 a 45 ng/uL y sus tamaños varían de 353 a 468 bp. Todas las muestras presentaron un número de lecturas aceptable para el estudio: entre 817.775 y 1.744.960 lecturas iniciales, y luego de filtradas entre 500.000 y 900.000 lecturas.La biodiversidad fúngica de la muestra estudiada fue analizada a distintos niveles taxonómicos. Preliminarmente, se pudo observar que la discriminación hasta Clase en las muestras en estudio coincide con algunos trabajos reportados en la literatura (Knapp et al., 2021; Martins et al., 2021), siendo Dothideomycetes la Clase predominante, con 83,1 a 95,3% de abundancia relativa. Además, una muy pequeña proporción de Microbotryomycetes y Agaricomycetes fue encontrada (menos del 2 y 1% respectivamente). Cabe mencionar que existe un porcentaje del Filo Basidiomycota, bastante menor comparado con Ascomicota (menor al 13,4%) sin identificar a mayor profundidad (incluso a nivel de Clase). En cuanto al nivel correspondiente a Orden, los más abundantes fueron Pleosporales (de 18,3 a 33,7%) y Capnodiales (de 18,4 a 36,6%), quedando un alto porcentaje sin identificar en este nivel, especialmente a la Clase de mayor proporción. Y avanzando en la clasificación taxonómica, se observó que la principal especie encontrada fue Cladosporium herbarum con una abundancia relativa de 18,4-36,6 %. En segundo lugar, se encontró un hongo del género Curvularia, en un porcentaje del 17,7-32,8%, y en tercer lugar un individuo sin identificar de la misma Clase (Dothideomycetes) con un porcentaje que oscila en las distintas réplicas del 17,3 al 53,5%. El resto de los hongos identificados tuvieron un porcentaje inferior al 16%, siendo entre ellos los siguientes: un organismo del Phylum Basidiomycota y otros del Phylum Ascomicota, Audeobasidium thailandense, Candida albicans, Curvularia hawaiensis y un hongo de la familia Xylaniacea. Cabe mencionar que en nuestras muestras no se encontró el microorganismo Audeobasidium pullulans, el cual es mayoritario en superficie de uva de varias regiones vitivinícolas (Onetto et al., 2021), incluso en nuestros propios estudios previos dependientes de cultivo realizados en viñedos de la misma zona (Merín et al., 2011; Longhi et al., 2022). Este microorganismo pertenece a la clase Dothideomycetes, orden Dothideales, familia Auerobasidiaceae. Es probable que esté incluido en un orden que no se logró identificar a mayor profundidad. Por lo tanto, los resultados encontrados permiten dar a conocer una primera aproximación de la composición de la microbiota fúngica, lograda mediante estudios de metagenómica, asociada a la superficie de uvas de un terroir específico de la región vitivinícola de la región del Oasis Sur de Mendoza. Estudios futuros son necesarios para confirmar estos hallazgos, así como estudios metagenómicos de superficie de uva adicionales de distintas añadas, otras zonas vitivinícolas y diferentes variedades.