Expresión heteróloga de una lacasa en Pichia pastoris

MOLINA MELISA ANTONELLA; WINNIK DANIANA; FARIÑA JULIA INÉS; BUSSI MARÍA VICTORIA; VILLALBA LAURA; ZAPATA PEDRO; FONSECA MARÍA ISABEL

Mendoza

Congreso; Congreso Nacional de Micología Carlos Spegazzini, XXXVI Jornadas Argentinas de Botánica; 2017

Asociación Micológica Carlos Speganzzini

Phlebia brevispora secreta la enzima Lacasa que se puede utilizar en aplicaciones industriales. Para ello es necesario producirla en grandes cantidades y una manera de lograrlo es expresarla en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. El objetivo del trabajo fue obtener la región codificante de una lacasa de P. brevispora y expresarlo en P. pastoris. El hongo creció en condiciones estandarizadas para obtener el ARNm. La región codificante se obtuvo por RT-PCR con primers específicos que contemplaban o no la inclusión del péptido señal, los cuales fueron subclonados en pPIC3.5K y pPIC9.K respectivamente utilizando Escherichia coli y medio con ampicilina para la selección. Los plásmidos obtenidos por lisis alcalina y secuenciados fueron digeridos con SacI para transformar P. Pastoris, los recombinantes fueron seleccionados mediante la aparición de un halo verde en medio metanol minimo (MD) con ABTS. Luego fueron crecidos en MD y la actividad lacasa fue monitoreada espectrofotométricamente.La región codificante consistió en un ORF de 1563pb que codifica para 521 aa. El gen clonado usando el péptido señal del factor de apareamiento de Saccharomyces cerevisiae (500 U/L) fue más eficiente para dirigir la secreción de la proteína recombinante que el péptido señal nativo (30 U/L). Estos resultados confirman que P. pastoris es apropiado para producir lacasa, sentando las bases para futuras investigaciones de la proteína, como así también para su aplicación en diferentes procesos.