Tolerancia a factores de estrés y capacidad de deterioro del vino de Dekkera bruxellensis

MERÍN, MARÍA GABRIELA; KONINCKX, JUSTINE; GARAU, JULIANA; TAPIA, MARÍA LUISA; MORATA DE AMBROSINI, VILMA INÉS

Mendoza

Congreso; 1º Congreso Interuniversitario de Mendoza I+D+i; 2021

UCA, UCH, UC, UM, UDA, UMAZA, UNCUYO, UTN

La especie Dekkera bruxellensis es actualmente la principal amenaza microbiológica para la calidad del vino tinto debido a su capacidad para producir fenoles volátiles como 4-etil-fenol y 4-etil-guayacol asociados a defectos sensoriales como ?sudor de caballo?, ?establo? o ?medicinal?, causando pérdidas económicas significativas en el sector vitivinícola mundial. Argentina es el quinto productor de vino del mundo y la región vitivinícola DOC San Rafael del occidente del país presenta un microclima especial que contribuye a distinguir sus viñedos y permite la elaboración de vinos reconocidos a nivel internacional. Se ha reportado que algunos factores o constituyentes del vino como el etanol, pH, concentración de azúcar y oxígeno, juegan un rol clave en el crecimiento celular y, consecuentemente, sobre la producción de los fenoles volátiles. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la tolerancia de la especie D. bruxellensis a dos factores de estrés del vino, el pH y la concentración de etanol, así como también la capacidad de sobrevivir y desarrollarse en un vino Malbec y alterar su aroma. En este estudio, se utilizaron dos cepas de la especie D. bruxellensis (V1-E y V3-4-11) seleccionadas entre la micobiota de ambientes vitícolas y enológicos previamente aislada desde la DOC San Rafael. Para estudiar la tolerancia a los factores de estrés presentes en el vino, se determinó la cinética de crecimiento de las cepas de levadura seleccionadas bajo condiciones de semi-aerobiosis. Se condujeron fermentaciones en tubos Falcon con 45 mL de un medio modelo (medio sintético) conteniendo 6,7 g/L de YNB con aminoácidos (Yeast Nitrogen Base, Difco), 2,5 g/L de D-glucosa, 2,5 g/L de D-fructosa, 50 µg/L de biotina, esterilizado por filtración utilizando una membrana de 0,22 µm de tamaño de poro. Para ensayar la tolerancia a distintos valores de pH del vino, se adicionó HCl (4 N) hasta ajustar el pH a valores de 3,0; 3,5 y 4,0. Para evaluar la tolerancia al etanol, se adicionaron concentraciones crecientes de etanol absoluto hasta alcanzar un contenido de alcohol del 5%, 10% y 15% (v/v) a un pH 3,5. Se prepararon los inóculos correspondientes en el medio YPG-etanol (10 g/L de glucosa, 5 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5% (v/v) de etanol, pH 4) incubados con agitación (100 rpm) a 28ºC durante 24 h. Se realizó el recuento en Cámara de Neubauer para dar una población inicial en el medio modelo de 105 células/mL. Se condujeron las micro-fermentaciones por duplicado a 25ºC con una agitación manual diaria. Se midió la densidad óptica a 600 nm cada 12-24 h para seguir el crecimiento poblacional de células hasta alcanzar la fase estacionaria. Para cada curva de crecimiento, se calcularon los siguientes parámetros: densidad óptica máxima (DOmáx), la fase de adaptación o latencia (fase lag) y, finalmente, la velocidad específica de crecimiento máxima (µmáx). Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron utilizando el programa Infostat (Córdoba, Argentina, 2020). Para comprobar la tolerancia a los factores pH y etanol combinados y estudiar el impacto en la calidad del vino de las cepas de levadura alterantes, se llevaron a cabo fermentaciones en tubos Falcon con 45 mL de vino experimental de la variedad Malbec (pH 3,7; 13,7% v/v de etanol; 0,5 g/L de azúcar residual), previamente esterilizado por filtración (membrana de 0,22 µm de tamaño de poro), siguiendo las mismas condiciones de inoculación y fermentación que en el ensayo anterior. Para evaluar el crecimiento microbiano, se realizó el recuento de viables (UFC/mL) por medio de plaqueo en superficie sobre el medio YPD-agar. Sobre los vinos resultantes se llevó a cabo el análisis físico-químico del vino de acuerdo a protocolos propuestos por el INV, el análisis cromático del vino calculando los índices clásicos de color (intensidad colorante, tonalidad) y la proporción de pigmentos amarillos, rojos y azules, así como también el brillo del color, dA(%), previa lectura espectrofotométrica de absorbancia a 420 nm, 520 nm y 620 nm de los vinos. Asimismo, se realizó un análisis de aroma del vino por comparación con los vinos control usando la prueba triangular para determinar la presencia de cualquier diferencia sensorial perceptible en el aroma por la vía ortonasal, mediante jueces entrenados y semi-entrenados. El estudio del efecto del pH sobre el crecimiento de la cepa D. bruxellensis V1-E mostró una relación directa entre el pH y la velocidad específica máxima de crecimiento, sin embargo, el máximo tamaño poblacional y la menor fase de adaptación se observó a pH 3,5. En cambio, la cepa D. bruxellensis V3-4-11 mostró una mayor velocidad específica de crecimiento a pH 3,0 y 4,0 que a pH 3,5 con un tamaño poblacional máximo a pH 3,0. Esto demuestra la tolerancia de las cepas de esta especie a factores adversos como pH bajos, sugiriendo que es una característica dependiente de la cepa. En cuanto al estudio del efecto de la concentración de etanol sobre el crecimiento, se observó que a medida que aumentaron los niveles de etanol, disminuyó la velocidad específica máxima de crecimiento de las cepas estudiadas, así como el máximo tamaño poblacional, mientras que aumentó la fase de adaptación. Además, se evidenció que ninguna de las cepas fue capaz de tolerar una concentración de etanol del 15% (v/v). Los ensayos de fermentación en vino Malbec mostraron que probablemente las cepas entraron en un estado viable no cultivable, debido a que no se detectaron células viables a partir del tercer día de incubación para la cepa V1-E y del primer día para la cepa V3-4-11, aunque se detectó el aroma característico del 4-etil-fenol (sudor de caballo, establo) en los vinos fermentados con la cepa V1-E a partir del día 14 de fermentación y del día 29 en los vinos inoculados con la cepa V3-4-11. No se observó alteración significativa en los parámetros de color del vino en el período de tiempo estudiado (30 días). Las cepas de D. bruxellensis demostraron ser capaces de crecer bajo condiciones ambientales severas existentes en el vino y permanecer metabólicamente activas en condiciones reales de vinificación alterando el aroma del vino. El conocimiento de las condiciones de crecimiento de esta peligrosa especie en enología y de su impacto en la calidad del vino contribuye con el desarrollo de estrategias más precisas de prevención y control de la misma para evitar el deterioro del vino.