PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA NP DE SARS-COV-2 EMPLEANDO EL SISTEMA FASTAG Y SU APLICACIÓN PARA USO DIAGNÓSTICO

HARGUINDEGUY INES; BEZUS BRENDA; BRACHO JUAN PABLO; RAMÍREZ ANDREA; CAVALITTO SEBASTIÁN; ORTIZ GASTÓN

Simposio; Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (Saprobio) 2021; 2021

El coronavirus SARS-CoV-2, causante del síndrome respiratorio COVID-19, posee un ssARN envuelto por una nucleocápside proteica. Las proteínas de la cápside tienen la capacidad de generar una respuesta humoral de anticuerpos IgG/IgM, que pueden ser utilizados para detectar personas infectadas. En particular, se destaca la proteína Np dado que presenta escasa homología con nucleoproteínas de otros coronavirus, siendo un blanco ideal para el desarrollo de sistemas diagnósticos que permitan la detección de anticuerpos IgG/IgM anti-Np en muestras serológicas. Por otro lado, nuestro grupo ha desarrollado y patentado un novedoso sistema de etiquetado llamado FasTAG, que permite la purificación e inmovilización de proteínas recombinantes sobre la superficie de bacterias Gram +. En este sistema, las proteínas recombinantes expresadas en sistemas heterólogos son fusionadas al dominio C-terminal de las proteínas de Capa-S de Lactobacillussp (FasTAG). Luego, se emplea la afinidad intrínseca que posee dicho dominio por las membranas de las bacterias Gram + para la purificación de las proteínas recombinantes de interés. Sobre la base de lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la funcionalidad del sistema para purificar la proteína Np fusionada al FasTAG, y su posterior aplicación en tiras reactivas para uso diagnóstico. Para ello, la secuencia de la proteína Np fue clonada en marco con el FasTAG en el vector pBam (BambooBiotech®) y expresada en Escherichia coli BL21 CodonPlus. La producción se realizó a 37 ºC y 250 rpm, en Erlenmeyer conteniendo medio LB e IPTG 1 mM como inductor. Posteriormente, se obtuvo un lisado celular en el cual se encuentra presente la proteína recombinante Np-FasTAG. Dicho lisado se incubó en batch durante 2 horas a 25 ºC con una matriz constituida por B. subtilis inactivado con formol 3%. A continuación, la suspensión se centrifugó y el precipitado se lavó para eliminar las proteínas no retenidas o retenidas en la matriz de forma inespecífica. Luego, la proteína de interés fue eluida durante 1 hora a 25 °C empleando LiCl 5 M, y cada una de las fracciones fueron analizadas mediante SDS-PAGE. El ensayo demostró la potencialidad de este sistema para la purificación de la proteína Np, logrando purificar 7,2 µg de proteína por mg de resina. Posteriormente, la proteína purificada se utilizó para evaluar su potencial uso como antígeno de captura en un sistema de inmunoensayo de flujo lateral. El mismo cuenta con un diseño sándwich, en donde los anticuerpos humanos IgG/ IgM anti-Np reaccionan con el oro coloidal conjugado a anticuerpos anti-humano (cabra), y luego son capturados por el antígeno recombinante Np dispensado en la línea de testeo. Como control se dispensó anticuerpo anticabra (conejo) en la línea de control. Las tiras reactivas resultantes se ensayaron empleando sueros reactivos y no reactivos para SARS-CoV-2, y se registró la intensidad de color (señal) obtenida en la línea de testeo. Se logró la detección de anticuerpos IgG/IgM en muestras serológicas empleando un panel de 20 sueros positivos y negativos. Como resultado, se logró aplicar el sistema FasTAG en la purificación de la proteína Np, y la misma fue empleada con éxito en la detección de anticuerpos IgG/IgM reactivos para SARS-CoV-2, revelando la potencialidad y funcionalidad de este sistema para su uso en la purificación de Np con fines diagnósticos.