DESARROLLO DE UN INMUNOENSAYO DE FLUJO LATERAL PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS COVID19

BEZUS BRENDA; BRACHO JUAN PABLO; RAMÍREZ ANDREA; HARGUINDEGUY INES; MANESE VICTORIA; CAVALITTO SEBASTIÁN; ORTIZ GASTÓN

Simposio; Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (Saprobio) 2021; 2021

El Coronavirus SARS-CoV2 causa el síndrome respiratorio COVID-19, declarado pandemia por la OMS en el año 2020, se caracteriza por tener una nucleocápside proteica que envuelve el ssARN viral. Estas proteínas, generan una buena respuesta humoral de anticuerpos IgG/IgM que pueden ser utilizados para identificar personas infectadas. La proteína Np de la nucleocápside SARS-CoV2 posee poca homología con nucleoproteínas de otros coronavirus y por ello se convierte en un blanco ideal para el desarrollo de sistemas diagnósticos basados en inmunoensayos. En particular, el desarrollo de tecnologías del tipo point of care (PoC) permiten detectar rápidamente personas infectadas en los puntos de atención primaria. Por ello, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un inmunoensayo de flujo lateral (IFL) que permita la detección de anticuerpos IgG/IgM anti-Np en muestras serológicas de forma rápida y sencilla. Para ello, la secuencia de la proteína Np fue clonada y expresada en Escherichia coli. La producción fue realizada a 37ºC y 250 rpm empleando Erlenmeyer conteniendo medio LB e IPTG 1 mM como inductor. Posteriormente, la proteína fue purificada mediante cromatografía de afinidad (IMAC-Ni+2) y empleada en la puesta apunto del inmunoensayo. Al efecto, se utilizó un diseño sandwich en donde los anticuerpos anti-Np IgG/IgM (humanos) reaccionan con el oro coloidal conjugado a anticuerpos anti-humano (cabra) y posteriormente capturados por el antígeno recombinante Np dispensado en la línea de testeo. Como control del ensayo se dispensó anticuerpo anti-cabra (conejo) en las líneas de control. Para optimización del ensayo se realizó un diseño experimental de tipo compuesto central, cuyas variables fueron: concentración de BSA en el bloqueo del conjugado (0,75-1,25 %p/v); BSA en el bloqueo de la membrana (0,5-1,5 %p/v), BSA en la formulación de la proteína Np (0,25-0,75 %p/v) y caseína en el bloqueo de la membrana (0,25-0,75 %p/v). Las tiras reactivas resultantes, se ensayaron empleando sueros reactivos (SR) y no reactivos (SNR) para COVID-19 y se registró la intensidad de color (señal) en la línea de testeo como señal específica en SR e inespecífica en SNR. La condición óptima se determinó como aquella que minimiza la señal inespecífica y maximiza la específica. Como resultado, se obtuvo de forma recombinante la proteína Np de SARS-CoV2 y pudo ser empleada con éxito en la elaboración de un prototipo de prueba diagnóstica. Del diseño factorial, se determinó que las condiciones óptimas para la elaboración de las tiras reactivas son: 0,75 %p/v de BSA en el bloqueo del oro conjugado; 0,6 %p/v de BSA en la formulación de la proteína y 0,6 %p/v caseína más 1 %p/v de BSA para el bloqueo de membrana. En estas condiciones, se logró la detección de anticuerpos IgG/IgM en muestras serológicas con una especificidad y sensibilidad diagnóstica del 87% y 95%, respectivamente. Finalmente, la rapidez y sencillez del ensayo aquí presentado surge como una alternativa para la detección de personas infectadas en los puntos de atención primaria.