Aplicación de una técnica molecular en la detección temprana de Escherichia coli productor de toxina Shiga en heces de origen pediátrico

SALINAS AG, ESCUDERO ME

San Luis

Congreso; V Congreso Multidisciplinario de Salud Comunitaria del MERCOSUR; 2010

Universidad Nacional de San Luis

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) causa colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). Éste se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia, y falla renal con una tasa de mortalidad infantil del 5% (Spizzini y col. 1997). Si bien E. coli O157:H7 ha sido más frecuentemente asociado a SUH, otros serotipos pueden causar similar enfermedad. El ganado bovino se considera el principal reservorio de STEC pero este microorganismo también ha sido aislado de heces de ovejas, caballos, perros y cerdos, entre otros. Las vías de transmisión a humanos más frecuentes son productos cárnicos insuficientemente cocidos y vegetales frescos contaminados, jugos de fruta y bebidas no pasteurizados, el contacto con personas infectadas y la exposición a animales o su medioambiente (Rivas y col. 2008). En estudios realizados en los años ?90 en nuestro país, se encontró evidencia de infección por STEC en 59% de casos de SUH y 20% de los transplantes de riñón en niños y adolescentes argentinos se debieron a este síndrome (Exeni, 2001). El número creciente de casos de niños pequeños con cuadro de diarrea hemorrágica que evoluciona a SUH y muerte, registrado en la provincia de San Luis en los últimos años, coloca al Laboratorio de Microbiología público y privado en el compromiso de obtener resultados que confirmen la infección por STEC en el menor tiempo posible para establecer el tratamiento terapéutico apropiado con la mayor urgencia. Los métodos tradicionales de cultivo requieren al menos 24 h desde la siembra de la muestra hasta la obtención de colonias características de E. coli en los medios de aislamiento recomendados, las cuales pueden ser ensayadas inmediatamente frente a antisueros O157 y H7. Otras 24 h son necesarias para la identificación de los aislamientos por pruebas bioquímicas. A continuación, las cepas sospechosas son enviadas al Laboratorio de Referencia del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ?Dr. Carlos G. Malbrán? (Buenos Aires) para su tipificación completa y la detección de factores de virulencia por métodos fenotípicos y moleculares. Cuando estos resultados están disponibles, ha transcurrido un tiempo apreciable durante el cual no se tomaron adecuadas medidas preventivas y de contención en el círculo familiar o escolar del paciente, y de control epidemiológico en la comunidad. Estos procedimientos tienen el grave inconveniente de sesgar el diagnóstico porque excluyen la posibilidad de detección de cepas no O157 no H7, y no informan la presencia de toxinas Shiga, importantes factores de virulencia en cepas relacionadas con los cuadros clínicos más severos. En nuestro Laboratorio se aplicó por primera vez una variante de reacción en cadena de la polimerasa (PCR múltiple), directamente sobre heces de origen pediátrico, para detectar los genes stx1 y stx2, correspondientes a toxinas Shiga 1 y 2, respectivamente. Este protocolo, diseñado por Leotta y col. (2005), ha demostrado alta sensibilidad en la detección precoz de la infección por STEC en niños con diarrea sanguinolenta y antes de que reciban tratamiento con antimicrobianos, pero se había aplicado exclusivamente en cepas aisladas por cultivo de las muestras en medios de enriquecimiento y selectivos (Varela y col. 2008). En nuestro trabajo se obtuvo amplificación de las secuencias blanco en muestras artificialmente contaminadas con distintas concentraciones de E. coli O157:H7 hasta un límite de 107 ufc/g de heces, lo que correspondió a 1,3 x 104 ufc/25 µl de reacción en el microtubo de PCR, y en una muestra de paciente de 3 años con síntomas de colitis hemorrágica, después de 2 h de enriquecimiento en caldo EC. La contaminación natural por E. coli STEC en esta muestra fue estimada en 4,5 x 107 ufc/g de heces en agar Sorbitol Mac Conkey (SMAC). Se utilizaron controles positivo, negativo e interno de amplificación. Este procedimiento aporta muy valiosa información sobre el potencial patogénico de la cepa en un tiempo aproximado de 4 h, mientras se realizan los cultivos que permiten el aislamiento y caracterización fenotípica y antigénica del microorganismo. Esta técnica de detección temprana de STEC y de confirmación a partir de cultivo puesta a punto en nuestro Laboratorio, se encuentra actualmente a disposición de los centros de diagnóstico de nuestra región.