AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE UNA PROTEASA SERÍNICA (HTRA) DE HELICOBACTER PYLORI, UN POTENCIAL BLANCO TERAPÉUTICO PARA ERRADICAR LA INFECCIÓN

ORIGONE, ANABELLA L.; D. VALLES; SALINAS IBAÑEZ ANGEL G,; A. E. VEGA; BARBERIS, SONIA E.

Santiago de Chile

Jornada; IV Simposio Latinoamerica y biocatalisis y biotransformaciones. III Jornada de Biocatalisis; 2022

Universidad Nacional de chile

Helicobacter pylori es un importante patógeno que coloniza el epitelio gástrico y daña la integridad de la mucosainduciendo ulceras y cáncer gástrico a través de sus factores de virulencia. Entre ellos se incluyen una proteínacodificada por el gen A asociado a citotoxina (CagA), una citotoxina vacuolizante A (VacA) y una serina proteasaA (HtrA). Las proteínas HtrA representan una clase de proteasas serínicas inducidas por choque térmico queestán involucradas en la interrupción de las uniones estrechas y adherentes de las células epiteliales. En H.pylori, el desprendimiento de la proteína de adhesión E-cadherina altera las funciones de la barrera epitelialpermitiendo que el microorganismo acceda al espacio intercelular durante la infección. El objetivo de este trabajofue aislar, caracterizar y purificar la proteasa serínica HtrA de H. pylori, para evaluarla como un posible blancoterapéutico relevante.La cepa de referencia H. pylori NCTC 11638 fue cultivada en agar sangre e incubada 48 h a 37 °C en condicionesde microaerofilia. Las colonias fueron colectadas y suspendidas en caldo infusión cerebro - corazón parafavorecer la secreción de HtrA. La suspensión se incubó a 37 °C con agitación de 160 rpm durante 8 h, secentrifugó inmediatamente a 13.000 × g durante 10 min a 5 °C y se recogió el sobrenadante para su posteriorpurificación. El proceso de purificación se realizó en un equipo FPLC (Akta Prime Plus, General Electric),utilizando una columna cromatográfíca de intercambio catiónico HiTrap SP (Cytiva Global Life Sciences SolutionsUSA LLC) empacada con Sulfopropil-Sepharose, previamente equilibrada y lavada con tampón Tris-HCl 50 mM(pH 7,5). La elución se realizó con un gradiente lineal de cloruro de sodio (0-0,2 M) en el mismo tampón departida, a una velocidad de flujo de 2 mL/min. La cromatografía se controló espectrofotométricamente midiendola absorción a 280 nm. Se analizó la actividad caseinolítica de las fracciones colectadas; las que resultaronactivas se concentraron y almacenaron a -20 °C. Se realizaron zymogramas del sobrenadante y de las fraccionespurificadas. Las bandas de proteína se tiñeron en solución acuosa de Coomassie Brillant Blue R-250 0,2% (p/v)con etanol 30% (v/v) y ácido acético 7% (v/v). Es conocido que la las proteasas de la familia HtrA contienen undominio tipo quimotripsina en el N-terminal y al menos un dominio PDZ en el C-terminal, se ensamblan enoligómeros que conforman trímeros y éstos pueden dar formas oligoméricas superiores (Hansen y Hilgenfeld,2013). En el sobrenadante se detectaron al menos un monómero HtrA y dos oligómeros proteolíticamenteactivos, los cuales fueron separados por electroforesis SDS-PAGE. Las bandas fueron cortadas y analizadas porespectrometría de masa. Se proyecta realizar estudios de estructura – actividad que permitan encontrarinhibidores específicos de la proteasa HtrA secretada por H. pylori, los cuales podrían ser nuevos agentesterapéuticos para erradicar la infección