Aplicación de un plasmido recombinante como herramienta para la deteccion de mutaciones truncantes en los genes msh y brca1.

MARZESE D; REAL S; GOMEZ L; MAYORGA LS; ROQUÉ M

Mar del Plata , Argentina

Congreso; 50 Reunion Cientifica Anual de Sociedad Argentina de Investigación Clinica; 2005

SAIC

El sistema doble híbrido bacteriano se basa en la complementación funcional de dos fragmentos de una enzima, la cual produce un segundo mensajero necesario para la transcripción de ciertos genes, como el reportero -Galactosidasa. Nuestro grupo desarrolló un plásmido recombinante, con ambos fragmentos enzimáticos separados por un MCS, con el que al transformar bacterias carentes del segundo mensajero endógeno, se observó un fenotipo salvaje. El objetivo fue aplicar esta herramienta para detectar mutaciones truncantes en los genes MSH2 y BRCA1. Nuestra hipótesis fue que al insertar una secuencia de ADN humano entre ambos fragmentos, con un codón ?stop? prematuro, se produciría un solo fragmento no funcional; y en caso de ocurrir un evento de reiniciación de la transcripción luego del codón ?stop?, se obtendrían dos fragmentos, separados y por lo tanto tampoco funcionales. Se amplificó por PCR el ADN de un paciente portador de un codón "stop" prematuro en el gen MSH2. A su vez se generaron por PCR mutagénica tres productos del gen BRCA1: salvaje, con codón "stop" prematuro, y con corrimiento del marco de lectura. Se insertaron cada uno de los productos en el MCS del plásmido y se transformaron bacterias carentes del segundo mensajero endógeno. Se obtuvieron colonias de color azul (en presencia de X-Gal) en las bacterias transformadas con los insertos salvajes, y de color blanco en las transformadas con los genes alterados. Se corroboró por Western Blot la presencia de la enzima completa en las colonias azules, y su ausencia en las blancas. A su vez, se confirmaron eventos de reiniciación post codón "stop" en las colonias blancas, que no revirtieron su fenotipo. Concluimos que el plásmido diseñado es funcional y revierte el fenotipo de las bacterias, y de esta manera se plantea su posible uso como herramienta para diagnóstico de mutaciones truncantes comunes en distintos tipos de cáncer.