Deteccion de mutaciones humanas por evaluacion de fenotipo bacteriano

MARZESE D; REAL S; GOMEZ L; MAYORGA LS; ROQUÉ M

Mendoza, Argentina

Jornada; XII Jornadas Argentinas de Microbiologia; 2006

Asociación Argentina de Microbiología-Filial Cuyo, la Sociedad de Infectología de Mendoza y la Sociedad de Alergia, Asma e Inmunología de Mendoza.

La detección de codones de terminación prematuros (PSCs) en genes humanos es de gran utilidad para el diagnóstico genético de diferentes canceres hereditarios. El producto de los PSCs son proteínas truncas detectables por la maquinaria de traducción de levaduras o bacterias. Estas estrategias se basan en la construcción de plásmidos recombinantes, en los que es subclonado el gen humano de interés, río arriba de un gen reportero. Una de las limitaciones de los sistemas bacterianos es la producción de falsos resultados debido a eventos de re-iniciación de la traducción post- PSC. El objetivo de nuestro trabajo ha sido el desarrollo de un plásmido recombinante resistente a estos resultados falsos, basándonos en el sistema bacteriano ?doble híbrido? que consiste en la traducción in vivo de 2 fragmentos fusionados de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, cuya actividad permite observar un fenotipo bacteriano seleccionable. Al insertar un gen de interés en medio de ambos fragmentos, un PSC inhibe la actividad enzimática, y eventos de reiniciación de la traducción post PSC llevan a la producción de fragmentos separados no activos. Al insertar los genes brca1 y msh2 en el plásmido desarrollado, demostramos que el sistema detecta eficientemente PSCs en genes humanos, evidenciando por Western Blot la existencia de eventos de reiniciación de la traducción. La aplicación del sistema en una familia con cáncer colonorrectal hereditario mostró un correcto diagnóstico de homocigotas sanos y pacientes heterocigotas. Concluimos que el plásmido desarrollado es resistente a falsos resultados y es aplicable para la detección de PSCs en genes relacionados con distintas enfermedades.