Hallazgo de una delecion que marca un nuevo rumbo en el campo de la terapia génica antisentido de la distrofia muscular de duchenne.

FERREIRO VERONICA; GILIBERTO FLORENCIA; MUNIZ GARCIA MN; MARZESE DIEGO; ROQUÉ MARIA; SZIJAN IRENE

Mar del Plata

Congreso; LII REunion de la Sociedad Argentina de Investigacion Clínica; 2007

La Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes (1:3500 varones nacidos vivos). Es recesiva, ligada al X, progresiva y de evolución fatal. La distrofia muscular de Becker (DMB), menos frecuente (1:30.000) y más benigna, es llamada enfermedad alélica de la DMD, ya que si bien ambas enfermedades son producidas por alteraciones en un mismo gen, distintas mutaciones originan fenotipos diferentes (Worton y Thompson, 1988). El gen de la distrofina, mapea en Xp21.2, tiene una extensión de 2.4Mb y se transcribe principalmente a un ARNm de 14Kb. El gran tamaño del gen tiene una relación directa con su complejidad estructural y funcional. La distrofina de músculo tiene un peso molecular de 427kDa y está compuesta por 3685 aminoácidos (aa). Contiene 4 dominios: El dominio N-terminal, el dominio rod, el dominio rico en cisteínas y el dominio C-terminal. La función de la distrofina muscular es la de unir el citoesqueleto de la fibra muscular a la membrana sarcolémica estabilizándola, y transducir la fuerza producida en el interior del sarcolema hacia la matriz extracelular (Yoshida et al., 1994). El déficit completo o parcial de esta proteína produce inestabilidad de la membrana y finalmente lleva a la necrosis del tejido muscular. Las alteraciones moleculares que producen la DMD/DMB se clasifican en: 1. grandes deleciones (60%), 2. pequeñas mutaciones (30%), 3. duplicaciones (8%) y translocaciones (2%) (Den Dunnen et al., 1989). Las deleciones se localizan mayoritariamente en dos zonas calientes o ?hot spots? (regiones 5´ y central del gen) (Koenig et al., 1989). La diferente expresión fenotípica depende principalmente de la localización de la mutación dentro de la estructura del gen y de la existencia o no de corrimiento del marco de lectura (CML). La ?hipótesis del marco de lectura? sugiere que si la mutación afecta el marco de lectura, el fenotipo será DMD, y si la mutación no lo afecta, el fenotipo será DMB. Es decir que cuando se elimina un número no entero de codones, (número de nucleótidos distinto de 3 o sus múltiplos), se produce CML generándose un codón Stop prematuro que da origen a una proteína trunca que es rápidamente degradada causando un fenotipo severo. Ahora bien, cuando se elimina un número entero de codones, se conserva el marco de lectura. En este caso, la proteína obtenida será de menor tamaño, parcialmente funcional, pero correctamente anclada al sarcolema y escaparía parcialmente, a una degradación temprana, originando un fenotipo más leve. Si bien esta ?hipótesis del marco de lectura? (Monaco et al., 1988) se cumple en más del 95% de los casos, existen deleciones que respetando el marco de lectura producen una forma grave de distrofia muscular por estar situadas en regiones críticas del gen, así como mutaciones que generan CML fueron reportadas en pacientes con un fenotipo DMB leve. Lo que ocurre en este último caso es un rescate del CML como resultado del salteo de exónes (exón skipping), mediante un mecanismo de splicing alternativo, lo que logra, tras la pérdida de uno o más exónes, recomponer el marco de lectura obteniéndose una proteína incompleta pero eventualmente funcional (Fajkusova et al., 2001). En la actualidad no existe ningún tratamiento conocido que cure la distrofia muscular de Duchenne, ni que evite el deterioro muscular. La demanda cada vez más imperiosa del hallazgo de una cura para una patología tan severa, progresiva y fatal como la DMD, promovió que en la actualidad se establecieran numerosas líneas de investigación en el campo de la terapia génica. La más prometedora es el uso de oligonucleótidos antisentido. La identificación de fibras revertantes ha guiado a los investigadores a implementar el uso de oligonucleótidos antisentido para la terapia génica de DMD (van Deutekom y van Ommen, 2003). Mediante la hibridación con un oligonucleótido antisentido de una secuencia blanco en el ARNm se ha tratado de restaurar el marco de lectura a expensas de la pérdida de secuencias codificantes. El objetivo del presente trabajo es aportar información mediante el análisis minucioso de las deleciones halladas en los pacientes con diagnóstico clínico de DMD/DMB derivados al laboratorio en los últimos 10 años y predecir cual sería el mejor blanco para la terapia génica antisentido que permitiría transformar el fenotipo DMD en un DMB o incluso en uno asintomático en un mayor número de pacientes. Durante los últimos 10 años se analizó el ADN de 398 pacientes. Con diagnóstico clínico de DMD/DMB. El estudio molecular comenzó con un análisis de la presencia de 16 exónes amplificados en 4 PCRs multiplex que mapean en las zonas calientes de deleción (Giliberto et al., 2004). La confirmación de la presencia de una deleción y el análisis de su extensión se realizó por medio de PCR simplex de los exónes faltantes y de los contiguos a los mismos. Se verificó la conservación del marco de lectura mediante el análisis de la secuencia resultante luego del empalme de los exónes flanqueantes a la deleción (ejemplo: figura 1a). Algunos diagnósticos fueron complementados con estudios de segregación de alelos polimórficos en los que se analizó la segregación intrafamilia de hasta 11 STRs intragénicos según métodos ya descriptos (Ferreiro et al., 2005). Otros se utilizaron para la validación del método de amplificación multiplex de sondas ligadas (MLPA) (Schouten et al., 2002). Los productos amplificados en el ensayo de MLPA fueron analizados en un secuenciador ABI3100 y procesados mediante en software Genemaker. (ejemplo: figura 1b). Se identificaron 177 deleciones (45%) en los 398 pacientes analizados y se determinó el efecto sobre el marco de lectura. Se seleccionaron las deleciones sin CML encontradas sólo en los pacientes con fenotipo de DMB, con el fin de evaluar cuántas de las deleciones con CML en pacientes con DMD serían rescatadas mediante una terapia de salteo de exónes utilizando como oligonucleótido antisentido la secuencia codificante delecionada en los pacientes con DMB (Tabla 1). La deleción de los exónes 45-55 resultó el mejor blanco para la terapia génica antisentido ya que permitiría tratar a un 41% de los pacientes con CML y fenotipo DMD. Otras de las deleciones halladas en los pacientes con DMB también podrían ser utilizadas en esta terapia, pero el porcentaje de los pacientes con DMD beneficiados con ese tratamiento sería mucho menor (6-8%). En una familia con un afectado de DMB se identificó la deleción de los exónes 45-55 propuesta como mejor blanco para la terapia génica antisentido. La misma conserva el marco de lectura, lo cual coincide con el perfil clínico del paciente (figura 1a). Un estudio de segregación de alelos evidenció la deleción en su abuelo y madre. Un ensayo de MLPA confirmó la deleción en el paciente y su abuelo y la presencia de hemidosis en la madre (figura 1b). La ausencia de síntomas clínicos en el abuelo nos llevó a medir el nivel de CPK, resultando 854UI/L. El análisis de otros miembros de la familia reveló 3 mujeres portadoras y 2 varones asintomáticos (12 y 14 años de edad). Los resultados del estudio molecular demostraron que una mutación ?benigna? heredada del abuelo materno del afectado provocó sólo un afectado en la familia. La deleción de los exónes 45-55 fue descripta en otras poblaciones asociada a un fenotipo DMB. El hallazgo de los individuos asintomáticos fue fortuito, lo que permite sugerir que muchos individuos subclínicos probablemente no sean conscientes de portar una DMB muy leve, y la incidencia aceptada para DMB podría estar entonces subestimada. En resumen, se propone la deleción de los exónes 45-55 como el mejor blanco para el desarrollo de una única estrategia de terapia génica antisentido ya que permite mejorar el fenotipo de la mayor cantidad de pacientes con DMD. Utilizando esta misma estrategia podrían tratarse el 41% de todos los DMD con deleciones en el gen de la distrofina diagnosticados en nuestro laboratorio. Nuestro objetivo como servicio de diagnóstico e investigación es poder brindar un resultado a cada familia que lo solicite. Es por ello que las técnicas moleculares y estrategias utilizadas en estos años permitieron implementar un diagnóstico molecular de rutina para DMD/DMB. Por otro lado, la detección y caracterización de las deleciones en el gen de la distrofina no sólo fueron importantes en la confirmación molecular del diagnóstico clínico, sino que permitirán en el futuro, la aplicación de estrategias de terapia génica que apuntan a corregir el defecto genético de manera específica. Nuestra participación en esta línea de investigación radica en la implementación y mejoramiento del diagnóstico molecular de la patología, por lo que no estamos activamente comprometidos en la investigación para hallar una terapia génica efectiva para las DMD/DMB. Pero conocemos la situación, la esperanza, y la desesperación de las familias con niños con DMD bastante bien. Nuestra vasta experiencia en el diagnóstico de la enfermedad, nos ha puesto en contacto con numerosas familias que se interesan mucho en el tema y es sobre todo por ello que sabemos lo que está pasando. Creemos entonces que éste es el momento de analizar, identificar y caracterizar las mutaciones en el gen de la distrofina de los niños y establecer las bases de datos internacionales (las deleciones descriptas en este trabajo fueron volcadas en la base de datos de la Universidad de Leiden en Holanda). Mientras tanto, muchos científicos se encuentran desarrollando distintas estrategias de terapia génica que permitirán ayudar a cada niño en particular, por lo que es de suma importancia que cada uno de ellos conozca su mutación para esperar la solución específica a su problema. Es por ello que nos atrevemos a decir que si bien la cura parece lejana y el tiempo de espera será difícil, con el arduo trabajo que se está realizando el hallazgo de una terapia génica efectiva para la DMD o para mejorar su cuadro clínico ya dista mucho de ser un objetivo inalcanzable.