Desarrollo de un plásmido recombinante para ser utilizado como herramienta para detectar mutaciones truncantes

REAL S; GOMEZ L; MAYORGA LS; ROQUE M

Jornada; XX Jornadas de Investigación de la Universidad de Cuyo; 2005

Los genes apc, Mismatch repair (MMR), y BRCA1 y 2, relacionados respectivamente con cáncer de colon familiar poliposo (FAP), cáncer de colon familiar no poliposo (HNPCC), y cáncer de mama familiar, presentan en una frecuencia a veces superior al 90%, mutaciones que provocan proteínas truncas. A través de métodos indirectos de detección de estas mutaciones, como el denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), single strand conformational polimorphysm (SSCP), restriction fragment length polimorphysm (RFLP) y protein truncation test (PTT) 2, familias portadoras de mutaciones en los genes relacionados son diagnosticados en forma presintomática. Otra metodología indirecta consiste en utilizar la maquinaria viva de bacteria o levadura para detectar la presencia de codones de terminación prematuros (PTCs) en secuencias de los genes a analizar. En bacterias el método requiere el subclonado del fragmento en plásmidos con un gen reportero, y la posterior transformación de las bacterias. El método no ha sido confiable para ser utilizado en diagnóstico pues las secuencias eucariontes tienen fragmentos reconocidos por la maquinaria bacteriana para la iniciación de la traducción y si el fragmento a analizar posee un codón de terminación que provoca la terminación de la síntesis proteica, río abajo puede re-iniciarse la traducción provocando una señal falsa. El objetivo de nuestro trabajo es utilizar el sistema ?doble híbrido? para bacterias, como herramienta eficaz para detectar PTCs evitando el problema de reiniciación de la traducción en bacterias. El sistema bacteriano ?doble híbrido?, que permite un análisis in vivo de interacción proteica, se basa en la complementación funcional entre dos fragmentos (T18 y T25) del dominio catalítico de una adenilato ciclasa.Cuando ambos fragmentos son co-expresados como fragmentos separados no constituyen una enzima funcional. Sin embargo, si son fusionados esta unión resulta en una complementación funcional, y por lo tanto, en síntesis de AMPc. Nuestra hipótesis es que insertando una secuencia de ADN a analizar entre ambos fragmentos en un plásmido adaptado a un sistema de clonado direccional y eficiente, la presencia de un PTC en la secuencia insertada, daría por resultado la traducción de un solo fragmento no funcional; y en caso de ocurrir un evento de re-iniciación río abajo del PTC, se obtendrían dos fragmentos, pero separados y por lo tanto tampoco funcionales. Nuestros resultados preliminares muestran un subclonado eficiente de la secuencia T25 río arriba de T18; la posterior transformación de bacterias AMPc deficientes con este plásmido T18-25, revierte su fenotipo blanco, a rojo en un medio MacConkey (b). Como control fenotípico, las mismas bacterias sin transformar se observaron blancas (a). Nuestros resultados preliminares muestran un subclonado eficiente de la secuencia T25 río arriba de T18; la posterior transformación de bacterias AMPc deficientes con este plásmido T18-25, revierte su fenotipo blanco, a rojo en un medio MacConkey (b). Como control fenotípico, las mismas bacterias sin transformar se observaron blancas (a). Para validar el uso del plásmido T25-18 para detectar PTCs en genes humanos, se amplificó por PCR el exón 13 de un gen MMR (hMSH2), de un paciente con HNPCC previamente diagnosticado por nuestro grupo, que es portador de una mutación PTC en esa región. Como control se amplificó la misma región en un paciente sano previamente diagnosticado. Se transformó con el plásmido + inserto una cepa bacteriana AMPc deficiente, y desde éstas se aislaron colonias para poder separar alelos plaqueando en medio específico (X-gal) Se observaron colonias de color celestes en las bacterias transformadas con plásmido más inserto del alelo sano, y colonias blancas en las bacterias trasnformadas con plásmido más inserto del alelo mutado. Esto se corroboró por PCR y RFLP (Hae III solo reconoce y corta alelos sanos), a partir de colonias.