Fibrosis quística: identificación de la mutación DF508 a través de mutagénesis dirigida mediante PCR.

ROQUÉ M; PUSIOL, E; MAYORGA, L.S.

Mendoza

Congreso; XVI Reunión Científica Anual de la Sociedad de Biología de Cuyo.; 1998

Sociedad ARGENTINA DE INVESTIGACION BIOQUIMICA Y DE BIOLOGIA MOLECULAR (SAIB).

La fibrosis quistica (FQ) se hereda de forma autosómica recesiva y se caracteriza por la obstrucción de los conductos en pulmón, páncreas y tracto genital principalmente. La frecuenica de homocigota para el gen mutado es de 1 cada 2000-2500 nacidos vivos y de heterocigotas portadores del 4-5%. Se sabe que el gen CFTR codifica para una proteína trasnmembrana del tipo de las ATPasa involucrada en el trasnporte de iones cloruro a través de la membrana celular. Distintas mutaciones en el CFTR provocan cambios en los diferentes dominios de la proteína y se relacionan con el desarrollo de FQ. OBJETIVOS: detectar la deleción CTT en el codón 508 (mutacion DF508) en el CFTR en pacientes con FQ y en portadres, introduciendo mediante PCR un sitio de restricción aleloespecifico. MATERIALES Y METODOS: a partir de DNA de sangre total con EDTA se amplifico por PCR parte del exón 10 con un primer F que linda con el sitio de la deleción CTT y que introduce mediante un mismatch un sitio de corte para la enzima MboI, y un primer R que permite abarcar en el producto de amplificación un sitio de corte constitutivo para la misma enzima. Luegod e al incubación enzimática, se corrieron las muestras en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. RESULTADOS: el sitio de corte constitutivo fue reconocido por MboI en todas las muestras. El primer F introdujo una mutacion lindando con el sitio de la deleción CTT ; en caso de alelos mutados, la encimza MboI no corto por no completarse la secuencia a reconocer; en caso de alelos sanos la enzima corto al secuencia GTAC viéndose patrones de bandas muy caracteristicos para homocigotas sanos y para portadores respectivamente. No se obtuvo muestra de homocigota mutado. CONCLUSIONES: este análisis genético nos permitio desarrollar una metodologia distinta, evitando corridas de geles de alta resolución para detectar la diferencia de 3 pb o hibridación con oligos aleloespecificos para la detección de la DF508. La mutagenesis dirigida mediante PCR (PSM) tiene la ventaja de poder ser aplicada no solo para deleciones sino para cualquier otro tipo de mutacion genética. Es simple, de bajo costo, de alta sensibilidad y epecificidad, con baja probabilidad de falsos positivos y falsos negativos.