REACTIVACIÓN PARCIAL DE BIOCATALIZADORES PARA HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE TÉCNICAS DE DESPLEGAMIENTO Y REPLEGAMIENTO

FENOGLIO, CECILIA; ADRIANO, WELLINGTON; REGENHARDT, SILVINA; RUBIOLO, AMELIA; MAMMARELLA, ENRIQUE

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química; 2010

Asociación Química Argentina

La principal limitante para el uso de las enzimas como biocatalizadores en procesos industriales es su relativamente corta vida media. Entre las diferentes estrategias generalmente aplicadas para incrementar la estabilidad operacional, se encuentran el rediseño molecular de la enzima, el desarrollo de técnicas de inmovilización y la modificación del medio de reacción. La inactivación enzimática es un fenómeno complejo que tradicionalmente ha sido considerado con carácter irreversible. Sin embargo, en muchos casos es posible lograr revertirla, al menos parcialmente, desplegando completamente las estructuras enzimáticas incorrectas provocadas por la inactivación para que posteriormente la enzima se repliegue muy rápida y completamente a su estructura inicial activa. En el caso de enzimas inmovilizadas en soportes sólidos por unión covalente multipuntual, este replegamiento se ve favorecido por el ordenamiento molecular que provocan los múltiples enlaces enzima-soporte. Si bien el replegamiento de enzimas ha sido intensamente estudiado en relación a la producción de proteínas recombinantes, su uso como estrategia de reactivación de biocatalizadores enzimáticos parcialmente inactivados no ha sido abordado de una manera sistemática desde el punto de vista de la ingeniería del proceso. En el presente trabajo se analiza el proceso de reactivación de biocatalizadores con actividad proteásica por alfa-quimotripsina, que resultaron parcialmente inactivados durante su empleo en un proceso de hidrólisis de concentrado de proteínas de suero de quesería (WPC). La enzima alfa-quimotripsina (EC 3.4.21.1) es una serino-proteasa que hidroliza enlaces peptídicos entre aminoácidos aromáticos (Tyr, Trp, Phe, Met, Leu) desde el extremo carboxílico terminal. Los biocatalizadores enzimáticos fueron obtenidos inmovilizando alfa-quimotripsina tipo II de páncreas bovino (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA) sobre micropartículas de agarosa (Hispanagar S.A., Burgos, España) de 100μm de diámetro, activadas con glicidol (2,3-epoxi-1-propanol) hasta conseguir una concentración de 75μeq de grupos aldehídos por cm3 de soporte (glioxil-agarosa al 6%). En estas condiciones se obtuvieron biocatalizadores con una carga de enzima de 40 mg por gramo de soporte, con una actividad enzimática inicial de 60 UI/mg soporte. Los biocatalizadores de alfa-quimotripsina fueron empleados para reducir, mediante su hidrólisis, la alergenicidad de soluciones de WPC, trabajando a un valor de pH constante de 8 y 50 °C, hasta alcanzar un grado de hidrólisis de 8%. Antes de someterlos al proceso de reactivación, los biocatalizadores fueron reutilizados en sucesivos procesos de hidrólisis hasta alcanzar una actividad remanente del 10% de la inicial. La reactivación de los biocatalizadores parcialmente inactivados se realizó incubando los mismos por diferentes períodos de tiempo en diferentes soluciones de urea (1 a9 M) y/o guanidina (1 a9 M) a diferentes temperaturas. Finalizado el tratamiento, se realizó el lavado de los mismos con agua destilada y se los resuspendió en buffer fosfato 100 mM de pH 8,0. Los biocatalizadores sometidos al proceso de reactivación fueron reempleados en ensayos estándares de hidrólisis de WPC para constatar el grado de reactivación conseguido. Con la estrategia empleada, se alcanzaron resultados de entre 25 y 100% de reactivación, lográndose los mejores valores en presencia de urea 9 M o de guanidina 6 M. Los biocatalizadores que mostraron mayores valores de reactivación fueron sometidos a análisis por difracción de rayos X para evaluar el recupero de la naturaleza estructural de la enzima inmovilizada. Para tal fin se utilizó un difractómetro de rayos X marca Seifert (Ennepatel, Alemania), modelo JSO Debyeflex 2002 con goniómetro para polvos Rich Seifert MZ III, equipado con tubo de cobre y filtro de níquel. Los ensayos se realizaron sometiendo a las muestras a 30 kV de tensión y 25 mA de intensidad, con un ángulo de barrido de 60 > 2(tita) > 4°, a una velocidad de barrido de 1.2 2(tita)/min y con una constante de tiempo del rotámetro de 3 s, no encontrándose diferencias significativas entre los resultados obtenidos para los biocatalizadores recién preparados y los biocatalizadores reactivados, lo que podría indicar que se ha logrado la máxima estabilidad termodinámica. El hecho de que el proceso de reactivación sea rápido también sugiere que ese punto de referencia puede ser inducido por las uniones covalentes enzima-soporte, que permitirían conducir el proceso de replegado. En tal caso, podría asumirse que no resultaría necesario el desplegamiento total de la enzima para lograr su correcto replegamiento. Finalmente, puede concluirse que el desplegamiento/replegamiento de enzimas inmovilizadas constituye una técnica simple, rápida, económica y efectiva para producir la reactivación de este tipo de biocatalizadores en medio acuoso.