Bacterias ácido lácticas de origen bovino productoras de sustancias antimicrobianas.

ASTESANA, D.M. ; BLAJMAN, J.E.; ALTINA, M.G.; ROMERO SCHARPEN, A.; SOTO, L.P.; ZBRUN, M.V.; ROSMINI, M.R.; FRIZZO, L.S.

Casilda

Jornada; Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científicas 2011 Facultad de Ciencias Veterinarias ? UNL. XII Jornadas de divulgación técnico científicas, FCV ? UNR segunda reunión conjunta UNL ? UNR.; 2011

Las bacterias ácido lácticas (BAL) poseen efectos benéficos en la prevención y tratamiento de enfermedades intestinales. Uno de los medios por el cual alcanzan este efecto es debido a la producción de sustancias específicas como son las bacteriocinas. Estas son proteínas o péptidos producidos por algunas bacterias y que poseen actividad antimicrobiana frente a grupos bacterianos estrechamente relacionados. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar la capacidad de las bacterias ácido lácticas de origen bovino para producir sustancias con actividad antimicrobiana. Se utilizaron bacterias ácido lácticas autóctonas pertenecientes a la microbiota intestinal de terneros jóvenes, que fueron aisladas a partir de materia fecal extraída por masaje rectal. Las heces fueron transportadas refrigeradas en una conservadora hasta el laboratorio donde se realizaron diferentes diluciones en solución de Ringer 1/4. A partir de estas se sembraron placas con medio selectivo (agar LAMVAB) que se incubaron durante 48 h a 37°C en anaerobiosis. A partir de las placas se seleccionaron colonias tomando representantes de las diferentes morfologías presentes y se las repico en tubos y placas con medio MRS a 37°C por 24 h para asegurarnos un correcto aislamiento. A partir de los tubos con crecimiento fueron obtenidos los datos de velocidad de crecimiento, aspecto del cultivo, prueba de catalasa y morfología (bacilos o cocos). Los microorganismos obtenidos fueron conservados a -80°C utilizando glicerol al 30% como crioprotector. Cada microorganismo aislado fue cultivado en caldo MRS durante 18 h y previo tratamiento térmico se centrifugaron para obtener el sobrenadante o Extracto Libre de Células Sin Neutralizar (ELCSN). Posteriormente se modificó el pH llevándolo a un valor entre 6 y 6,5 y se los esterilizó por filtración obteniendo el Extracto Libre de Células Neutralizado (ELCN). Ambos extractos fueron congelados a -20°C hasta su utilización. La actividad antimicrobiana de cada cepa se evaluó por medio del método de difusión en agar. Los microorganismos indicadores fueron inoculados en el agar ensayo y después de ser colocados en la placa de petri se realizaron hoyos donde se colocaron los ELCSN y los ELCN. Las zonas de inhibición detectadas alrededor de los hoyos indicaron la presencia de sustancias inhibidoras. Los microorganismos que resultaron productores de sustancias antimicrobianas fueron identificados utilizando técnicas moleculares (amplificación del 16S rARN, secuenciación y comparación de bases de datos. El ADN fue recupero de acuerdo a la metodología de Marmur y modificada por Kurzak. La integridad del ADN fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa al 0,7% p/v. El gen 16S rRNA fue amplificado por PCR utilizando para ello los primers específicos 27F y 1492R1. Cada tubo de reacción (50 µl) contenía 10 µl 5X PCR buffer para Taq polimerasa, 1,5 mM MgCl2 200 µM de cada dNTP, 0,4 µM de cada primer y 2 µl de Taq polimerasa. El programa para el termociclador fue el siguiente: 94°C durante 5 min; 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min y 72°C durante 1 min; finalmente un paso de extensión a 72°C durante 7 min. Posteriormente los productos del PCR fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v el cual fue teñido con GelRed® y visualizado bajo luz UV. La comparación de las secuencias obtenidas se realizo on-line usando el algoritmo Blast del NCBI (National Center of Biotechnology Information) en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov. De los microorganismos aislados se obtuvieron tres cepas con capacidad antimicrobiana: 2 de ellas pertenecieron a la especie Pediococcus acidilactici y la restante fue un Lactobacillus plantarum. Una de las cepas de Pediococcus acidilactici presento las mejores características. La característica morfológica que presentó la colonia en la placa del medio selectivo agar LAMVAB fue de verde claro grande. Las características que presentó en el tubo fue un crecimiento mediano con características de arenilla y sin producción de gas. Resultó negativo en la prueba de catalasa. El pH que la cepa produjo en el medio de cultivo (caldo MRS) fue de 3,7. El ELCSN mostró actividad antimicrobiana frente a Enterococcus faecium, Salmonella dublin, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. El ELCN manifestó actividad antimicrobiana únicamente frente a Enterococcus faecium y Pseudomonas fluorescens. En conclusión la cepa mostró su poder inhibitorio y resulta interesante tanto para ser incorporada como tal a un inóculo probiótico como junto a la sustancia antimicrobiana que produce.