Caracterización fenotípica y subtipificación molecular de Pasteurella multocida

LEOTTA G.A., ; CHINEN I., ; WOLCOTT M.J., ; VIGO G., ; CHILLEMI G., ; PERFUMO J.C., ; RIVAS M.

Buenos Aires, Argentina

Otro; XV Reunión Científico Técnica; 2004

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

Pasteurella multocida es un importante patógeno para animales de cría intensiva y para aves silvestres. Es una bacteria gram negativa, capsulada, no móvil y según sus características bioquímicas se la puede clasificar en las siguientes subespecies, P. m. multocida, P. m. septica, P. m. gallicida, y recientemente se propuso P. m. tigris. Según el grupo capsular se las clasifica en A, B, D, E, y F, y de 1 a16 según el serotipo somático. Durante la última década se implementaron nuevos métodos moleculares para la subtipificación de P. multocida, tales como análisis con endonucleasas de restricción (RFLP), ribotipificación, electroforesis de campo pulsado (PFGE), métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de fragmentos polimórficos largos amplificados (AFLP) y tipificación de secuencias multilocus (MLST). En Argentina, el cólera aviar de curso crónico es la pasteurelosis diagnosticada con mayor frecuencia en aves domésticas, afectando principalmente a gallinas reproductoras. En los criaderos de cerdos la presentación de pasteurelosis está asociada a neumonía. Con respecto a las aves silvestres, se reportó cólera aviar en la Antártida, aunque no se describieron casos de la enfermedad en Argentina. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar fenotipicamente cepas de P. multocida aisladas de animales de cría intensiva en Argentina y aves silvestres de la Antártida, y realizar la subtipificación de las mismas por 2 técnicas moleculares. Se analizó un total de 40 cepas de P. multocida. Diez cepas fueron aisladas de cerdos con neumonía en la Provincia de Buenos Aires, 9 cepas de gallinas reproductoras con cólera aviar crónico aisladas en Argentina, y 3 cepas aisladas de aves antárticas. Para comparar los patrones moleculares se analizaron 2 cepas de aves domésticas, 1 de Australia y 1 de Uruguay, y 16 cepas de referencia (serotipos 1 a 16). La caracterización fenotípica se realizó por pruebas bioquímicas y por micrométodos (API-20E). Los serotipos capsulares fueron determinados por PCR multiplex y los serotipos somáticos por inmunodifusión en agar. Se determinó la concentración inhibitoria mínima por el método de microdilución con 11 antibióticos (NCCLS). La subtipificación molecular se realizó por ApaI-PFGE (5) y por Enterobacteriae Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR). Para ERIC-PCR se utilizaron los oligonucleótidos iniciadores ERICC1R y ERICC2. El análisis de los perfiles moleculares se realizó con el programa BioNumerics versión 3.2 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). El porcentaje de similitud entre los patrones se determinó por el número de bandas compartidas utilizando el coeficiente de Dice, y los dendogramas se construyeron mediante UPGMA. El poder discriminatorio de las técnicas se determinó por el índice de Simpson. Las cepas aisladas de cerdos fueron caracterizadas como P. m. multocida (n:10) y tipificadas como A:3 (n:4), D:3x5 (n:4), D:3 (n:1) y A:4 (n:1), 9 cepas fueron resistentes a tiamulina y 2 a estreptomicina. Las cepas aisladas de aves reproductoras fueron caracterizadas como P. m. multocida (n:7), P. m. gallicida (n:1) y P. m. septica (n:1), y presentaron los siguientes tipos, A:3 (n:3), A:1 (n:3), A:12 (n:1), NT:2x5 (n:1) y A:NT (n:1). La cepa de Australia fue caracterizada como P. m. gallicida A:1. La cepa de Uruguay como P. m. multocida A:3 fue resistente a enrofloxacina. Las cepas aisladas de aves antárticas fueron caracterizadas como P. m. gallicida A:1. Las cepas de referencia correspondientes a los serotipos 1 a 16, fueron caracterizadas como P. m. multocida (n:13), P. m. septica (n:2) y P. m. gallicida (n:1), cuyos grupos capsulares fueron A (n:11), D (n:1), B (n:1) y NT (n:3). Sobre un total de 40 cepas de P. multocida analizadas se detectaron 32 patrones ApaI-PFGE (identificados del 1 al 32) y 22 patrones ERIC-PCR (identificados del i al xxii), lo que demostró la diversidad genética que presentan estas cepas. Los patrones de restricción obtenidos por ApaI-PFGE presentaron entre 7 y 15 bandas bien definidas, de 40 a 400 kb, y al analizarlos fue posible observar 8 grupos clonales o clusters (identificados del I al VIII) con una similitud superior al 80%. A pesar de la diversidad genética observada, los patrones de restricción 17, 16, 9, y 14 se detectaron con mayor frecuencia, agrupando 4, 3, 3 y 2 cepas, respectivamente. Los patrones de amplificación obtenidos por ERIC-PCR presentaron entre 9 y 13 bandas, y fueron analizados en un rango comprendido entre 0.2 y 1.7 kb. Respecto a las cepas aisladas de cerdos se obtuvieron 2 grandes clusters, III y V. En el primero se agruparon 5 P. m. multocida tipo D, de las cuales 3 resultaron clonales por ApaI-PFGE. En el cluster V se agruparon 4 P. m. multocida A:3 que presentaron el mismo patrón de restricciónLas cepas aisladas de gallinas reproductoras presentaron mayor diversidad por PFGE. Dos cepas aviares de P. m. multocida A:1 resultaron clonales (patrón 14), al igual que las cepas aisladas de aves antárticas (patrón 16); ambos patrones se agruparon en el cluster IV. Tres cepas aviares (1 de Uruguay, 1 de Bs As y 1 de referencia), fueron caracterizadas como P. m. multocida A:3 y se agruparon en el cluster I. Los resultados obtenidos por ERIC-PCR se correlacionaron con los obtenidos por ApaI-PFGE. La utilización de técnicas moleculares para la subtipificación de cepas bacterianas se incrementó en los últimos 20 años, reconociéndose a PFGE como ?gold standard? en epidemiología molecular. Los resultados obtenidos en el presente trabajo coinciden con este concepto, ya que el coeficiente discriminatorio obtenido con ApaI-PFGE (D=0.99) fue superior al de ERIC-PCR (D=0.93). Los 8 clusters obtenidos se caracterizaron por agrupar a cepas de la misma subespecie, grupo capsular y serotipo. Las cepas de cerdo presentaron mayor clonalidad que las aisladas de gallinas reproductoras, posiblemente porque tuvieron una distribución más homogénea en tiempo y espacio. Las cepas de aves antárticas fueron idénticas fenotipica y genotipicamente, lo que sugiere que tuvieron un origen común, tratándose posiblemente de un clon que circula y tiene reservorio en la Antártida. Las técnicas de caracterización fenotípica y de subtipificación molecular, combinadas con una continua y sistemática vigilancia epidemiológica en animales de cría intensiva pueden contribuir al reconocimiento de brotes de pasteurelosis, a determinar el origen de los mismos, a determinar la transmisiónde P. multocida, a impedir la diseminación de cepas con resistencia a antibióticos, y a vigilar los programas de vacunación. El análisis final de los resultados obtenidos con estas técnicas puede contribuir al desarrollo de estrategias de prevención sanitaria para reducir y controlar la enfermedad