Análisis de vacunas 9R contra tifus aviar utilizadas en Argentina

LEOTTA G.A., ; VIGO G., ; SALVE A., ; PICHEL M., ; PECORARO M., ; BINSZTEIN N.

Buenos Aires, Argentina

Otro; XV Reunión Científico Técnica.; 2004

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

Introducción Tifus Aviar es una enfermedad infecciosa causada por Salmonella Gallinarum. Los planteles de aves comerciales de los países latinoamericanos atraviesan en la actualidad el peor momento sanitario respecto a la Salmonelosis. Para comprender la evolución de esta enfermedad en la avicultura Argentina, se describen 3 períodos: a) 1972-1977 con 1.377.600 aves afectadas, b) 1978-1993 con aparente control de la enfermedad, c) 1993-2003 con recrudecimiento zonal (1). A partir del segundo período se comenzó a utilizar la vacuna 9R. Esta vacuna está realizada con una cepa viva de S. Gallinarum en fase rugosa (R), estable y no patógena (2). La cepa 9R fue desarrollada por Williams Smith en 1956 y se caracteriza por la ausencia de lipopolisacarido (LPS) (3). En la actualidad se atribuye el recrudecimiento zonal de la enfermedad a la utilización de vacunas ineficaces, inadecuadamente controladas o mal utilizadas, y al abandono de medidas de bioseguridad (1). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la inocuidad, pureza y ausencia de cepas lisas (S) en 5 vacunas 9R que se comercializan en Argentina. Identificar y caracterizar las cepas vacunales y los aislamientos obtenidos en la prueba de inocuidad, mediante pruebas bioquímicas, serotipificación y subtipificación molecular. Materiales y Métodos Se analizaron 5 vacunas ?9R? (denominadas A, B, C, D y E) aprobadas para su comercialización en Argentina. Para la evaluación de las vacunas se adoptaron las recomendaciones del Manual de Procedimientos de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) (4). Pureza. Se realizaron diluciones en base 10 en caldo tripticasa soja de las 5 vacunas. Se sembraron 100 µl de cada dilución (10 -3 , 10 -4 , 10 ) por triplicado en agar base con 5% de sangre de carnero y en caldo tioglicolato. Inocuidad. Para cada una de las 5 vacunas se inocularon 6 pollos libres de patógenos específicos (SPF), machos de 12 semanas de edad, por vía subcutánea (SC) y 15 pollitos convencionales, machos de 2 días de edad, por vía intraperitoneal. Todas las aves se inocularon con 10 dosis vacunales. Por cada categoría de aves, se inoculó un lote control con solución fisiológica estéril. Las aves se observaron diariamente durante 1 semana. El día 7 posinoculación (PI) se sacrificó la totalidad de las aves y se realizó la necropsia. Las vesículas biliares y los hígados de las aves se sembraron individualmente en agar entérico hektoen, incubándose a 37ºC por 24 h. Identificación. Tanto las 5 cepas vacunales como los aislamientos obtenidos de la prueba de inocuidad, fueron caracterizadas mediante pruebas bioquímicas y por serotipificación. Se utilizaron sueros somáticos polivalentes OS-A y OS-B, y sueros somáticos monovalentes para serotipificar los aislamientos de S. Gallinarum S. Cepas lisas. Se observó la morfología de las colonias de las 5 cepas vacunales y de las recuperadas de la prueba de inocuidad, realizándose las pruebas en portaobjeto de acriflavina y de autoaglutinación en solución salina al 2%. Subtipificación. Se analizaron por electroforesis en campo pulsado (PFGE) con la enzima XbaI y por Enterobacteriae Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) las cepas vacunales, 14 aislamientos obtenidos en la prueba de inocuidad y 8 S. Gallinarum de diferentes regiones del país correspondientes a casos esporádicos. Resultados Pureza. No se hallaron microorganismos contaminantes en ninguna de las vacunas evaluadas. El máximo recuento de colonias fue 5,3 x 10 7 ufc/ml y el mínimo 1,4 x 10 ufc/ml. Las cepas vacunales fueron identificadas como S. Gallinarum R. Inocuidad. Aves SPF: no se registraron muertes ni se observaron síntomas clínicos de Tifus Aviar. Nueve aves presentaron lesiones en el sitio de inoculación, 1 inoculada con la vacuna A, 5 con la vacuna D, y 3 con la vacuna E. Se aisló S. Gallinarum S de un pollo con lesiones sistémicas inoculado con la vacuna D, y se aisló S. Gallinarum R del hígado de un pollo sin lesiones sistémicas inoculado con la vacuna E. Las aves inoculadas con las vacunas B, C y los controles, no presentaron lesiones locales ni sistémicas, y no se aisló S. Gallinarum a partir de sus órganos. Aves convencionales: en las aves inoculadas con las vacunas A, B, C y con solución fisiológica no se registraron muertes ni se observaron síntomas clínicos de Tifus Aviar. Cinco pollitos inoculados con la vacuna D murieron antes de los 7 días PI y presentaron lesiones de Tifus Aviar; se aislaron 2 S. Gallinarum R y 1 S. Los pollitos analizados después del día 7 PI no presentaron lesiones, aunque se aislaron 3 S. Gallinarum R y 1 S. Cuatro pollitos inoculados con la vacuna E murieron antes del día 7 PI y presentaron lesiones de Tifus Aviar; se aislaron 4 S. Gallinarum R. Los pollitos analizados después del día 7 PI no presentaron lesiones y del hígado de 1 pollito se aisló S. Gallinarum R. Las cepas vacunales y los aislamientos obtenidos en la prueba de inocuidad presentaron un mismo perfil electroforético por ERIC-PCR. Mediante PFGE las cepas de las vacunas A, B y C fueron clonales. Las cepas de las vacunas D y E y las aisladas de las correspondientes pruebas de inocuidad presentaron dos patrones de PFGE diferentes, uno para la vacuna D y otro para la E. A su vez, estos perfiles difirieron del patrón de las cepas aisladas de las vacunas A, B y C. Los 8 aislamientos no relacionados exhibieron perfiles diferentes de PFGE. Discusión Las epizootias de Tifus Aviar que afectaron a la avicultura nacional se debieron a la importación de reproductores contaminados, a la negación de la enfermedad con fines comerciales, al indiscriminado uso de antibióticos, al retraso en implementar medidas de bioseguridad y a la utilización de vacunas ineficaces (1). Los resultados obtenidos confirmaron que el control de las vacunas 9R que se comercializan en Argentina es insuficiente; ya que se hallaron lesiones en el sitio de inoculación en las aves SPF (vacunas A, D y E), murió el 33% y el 26% de los pollitos inoculados con las vacunas D y E respectivamente, y se aisló S. Gallinarum S en aves inoculadas con la vacuna D. Este último hallazgo señala la posibilidad de reversión de la cepa de la vacuna D. El análisis por PFGE mostró alto poder discriminatorio y permitió demostrar que las cepas vacunales utilizadas en la República Argentina son diferentes. En concordancia con estos resultados, la recuperación de cepas S y la muerte de pollitos en la prueba de inocuidad demuestran que 2 de las vacunas evaluadas no presentan las características descriptas por Williams Smith para la cepa 9R (3) y no cumplen con los parámetros postulados por OIE. Considerando los resultados obtenidos, se sugiere optimizar el control de inocuidad en las vacunas ?9R?, implementar la detección de cepas S, y evaluar la utilización de controles basados en técnicas de subtipificación molecular para evitar uno de los factores de riesgo de Tifus Aviar en Argentina, la utilización de vacunas ineficaces o mal controladas