DETERMINACIÓN FÍSICA DE LA FASE HAPLOTÍPICA POR PCR INVERSA ALELO-ESPECÍFICA: SU APLICACIÓN A LA INVERSIÓN DEL INTRÓN 22 (INV22) Y EL STR (CA)N DEL INTRÓN 21 DEL F8 EN FAMILIAS CON HEMOFILIA A (HA) SEVERA

ROSSETTI CL; RADIC CP; ABELLEYRO MM; MARCHIONE VD; LARRIPA IB; DE BRASI CD

Mar del Plata

Congreso; LVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC).; 2013

SAIC

El estudio físico de haplotipos (marcadores en cis) se hace por PCR alelo-específica (de corta-larga distancia) o por análisis de los pares terminales de clones. Aquí presentamos una técnica nueva, Physical Inverse-based Phasing (PIP), capaz de determinar la fase entre la INV22 y un STR (short tandem repeat) (CA)n del intrón 21 del F8 en portadoras INV22+. PIP puede haplotipar en larga distancia (5-50kb) pares de marcadores tipo SNP (single nucleotide polymorphism), STR y RFLP (restriction fragment length polymorphism). La HA es una coagulopatía ligada al X causada por mutaciones en el F8. Casi la mitad de las HA severas tienen la INV22 causada por recombinación homóloga. Objetivos: validar y aplicar el método PIP INV22/F8Int21(CA)n en familias con HA severa. Se estudiaron muestras de ADN leucocitario de 27 portadoras y 4 dúos (madre portadora-hijo afectado) INV22+ por IS-PCR (inverse shifting-PCR) amplificando por separado el alelo normal (primers 22B+ID) y el INV22 (primers 22B+ED) en un producto que incluye al STR F8Int21(CA)n; PCR anidada y electroforesis capilar para genotipar el alelo F8Int21(CA)n ligado. De 27 portadoras INV22+ estudiadas, 18 (67%) fueron informativas para el STR. El abordaje PIP permitió genotipar la fase INV22/F8Int21(CA)n en las 18 portadoras doble informativas. La validación del método PIP fue encarada en 4 dúos informativos (madre/hijo) comparando a ciegas el resultado del alelo F8Int21(CA)n asociado a la INV22 obtenido por la técnica PIP en la madre con el obtenido directamente en el hijo hemicigota dando una perfecta correlación. Por ejemplo, la madre muestra el alelo de 167pb del F8Int21(CA)n asociado a la INV22 y de 163pb al alelo normal por PIP y el hijo afectado muestra el alelo de 167pb. La técnica PIP permite el estudio físico directo de la portadora de HA para determinar la fase de la INV22 y el STR F8Int21(CA)n evitando el análisis de ligamiento en el árbol familiar, y se proyecta con utilidad en otras áreas de la medicina genómica.