Detección precoz del fitopatógeno Cercospora kikuchii en plantas de soja: validación de un método basado en una técnica de PCR

PERETTI CANALE, M.V.; MATTIO, M.C.; LATORRE RAPELA, M.G.

Santa Fe (Santa Fe, Argentina)

Congreso; III Cogreso Bioquímico del Litoral- XVI Jornadas Argentinas de Microbiología; 2015

Asociación Argentina de Microbiología y Colegio de Bioquímicos de Santa Fe

Las enfermedades de fin de ciclo (EFC) constituyen una significativa limitante para el cultivo de soja en Argentina, generando una gran preocupación en el sector agropecuario debido a que dicha oleaginosa es el principal cultivo extensivo del país. Una de las EFC de mayor prevalencia e incidencia actualmente es el tizón de la hoja y mancha púrpura de la semilla, causada por el hongo Cercospora kikuchii, que ocasiona severas reducciones del rendimiento y calidad, impactando negativamente en la producción y rentabilidad del cultivo, debido a que produce infecciones asintomáticas y latentes que retrasan la aplicación de medidas de control al no ser visualizadas o pasar desapercibidas.El empleo de técnicas de diagnóstico molecular, como PCR, permiten detectar al patógeno en etapas tempranas de infección con una elevada especificidad, sensibilidad y rapidez en comparación con los métodos tradicionales. Además, si el método es validado está garantizada la fiabilidad del resultado.El objetivo del presente trabajo fue validar una técnica de PCR para la detección precoz de Cercospora en plantas de soja inoculadas experimentalmente. Los principales criterios de validación analizados fueron sensibilidad (DSe) y especificidad (DSp) diagnóstica, eficacia (E) y valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN).Para tal fin, se trabajó con 45 muestras positivas (plantas infectadas experimentalmente con C. kikuchii NBRC 6711) y 44 muestras negativas (plantas sanas), acorde a lo establecido para una DSe y DSp estimada del 97% con una confianza deseada del 95% y un error permitido del 5%. A todas las muestras se les extrajo el ADN y posteriormente se realizó la amplificación de un fragmento de 264 pb del gen cfp, que codifica para la proteína CFP específica del género, empleando los oligonucleótidos CPF-1 y CFP-2. Como control positivo se utilizó ADN de Cercospora kikuchii NBRC 6711 y como control negativo agua milliq. Los productos de amplificación se visualizaron mediante electroforesis sumergida horizontal en gel de agarosa al 1,5 % (p/v).Para el análisis estadístico de los resultados se utilizo una tabla de contingencia que contempla los resultados verdaderos positivos (VP), falsos positivos (FP), verdaderos negativos (VN) y falsos negativos (FN) y se calcularon los parámetros de validación: sensibilidad diagnóstica (DSe=VP/(VP+FN)), especificidad diagnóstica (DSp=VN/(VN+FP)), eficacia (E=VP+VN/ VP+VN+FP+FN), valor predictivo positivo (VPP=VP/(VP+FP)) y valor predictivo negativo (VPN=VN/(VN+FN)), teniendo en cuenta que se considero positivo todo resultado en el que se observó un producto de PCR cuyo peso molecular se correspondía con el fragmento del gen cfp esperado, y negativo a todo resultado en el que no se observó amplificación para el mismo.La técnica de PCR presentó una sensibilidad diagnóstica de 93,3 % (IC95%= 86,1-100) y una especificidad diagnóstica de 88,6% (IC95%= 79,3-98). La eficacia fue de 91,0% y los valores predictivos positivos y negativos de 89,4% y 92,9%, respectivamente.En base a los valores obtenidos, se puede concluir que la técnica de PCR presentada ofrece resultados positivos y negativos que permiten confirmar o descartar la presencia del patógeno Cercospora con un elevado nivel de confianza, brindando una herramienta útil para la detección precoz.