Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kéfir Argentinos.

HAMET M F; LONADERO A; PIERMARÍA J; GARROTE G L; ABRAHAM A. G.

Congreso; XII Congreso Argentino Microbiología. Buenos Aires; 2010

El gránulo de kéfir está constituido en un 8 % por kefiran, un exopolisacárido (EPS) producido por  Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens. Este EPS posee propiedades funcionales comprobadas, actúa como gelificante, espesante y formar películas comestibles. Además posee capacidad de proteger el epitelio y actividad inmunomodulatoria. Su aislamiento es dificultoso ya que es anaerobio estricto y de crecimiento lento. El objetivo del trabajo es aislar L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kéfir argentino y analizar las propiedades reológicas de los cultivos crecidos en leche. Debido a la falta de consenso acerca de la microflora existente en gránulos de kéfir, se analizo mediante una técnica molecular independiente del cultivo la presencia de  dicho microorganismos en 9 gránulos de la colección CIDCA. Para eso se les extrajo el DNA total (kit de purificación  Accuprep Genomic DNA (BIONNER)) y se amplifico con los oligunucleótidos sintéticos 518r y GC-338f. Estos productos y el obtenido de la cepa de referencia L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens JCM 6985 fueron analizados mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (urea/formamida 40-60 % , 16 horas, 100 Voltios y a 60°C, SYBR gold). Las bandas coincidentes con la cepa de referencia fueron cortadas, amplificadas y secuenciadas. A partir de la confirmación de la existencia de la cepa buscada se procedió al aislamiento. Se utilizaron tres técnicas de disgregación de gránulos de kefir: ruptura con ultraturrax, congelamiento y corte mecánico y disolución del gránulo en agua a 40°C. A partir de cada una de las suspensiones se realizaron aislamientos directos por estrías en agar y con previo enriquecimiento en medio líquido (MRS pH 5, 7 días y anaerobiosis). Se obtuvieron 23 aislados y fueron caracterizados mediantes coloración de Gram, presencia de catalasa, capacidad de crecer en leche, producción de gas de glucosa y perfil de proteínas totales (SDS-Page). La evaluación reológica se realizo en un reómetro Haake Rheostress 600 en modo rotacional. En base a los perfiles de proteínas se construyo un dendograma donde se pudieron agrupar 8 aislados con la cepa buscada. A fin de confirmar su identidad se les extrajo DNA, amplifico y analizo por DGGE. Se utilizaron como referencias las cepas L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens JCM 6985, L. kefiranofaciens subsp. kefirgranum JCM 8572 . Las bandas fueron secuenciadas y contrastada en una base de datos. Del total de 23 cepas aisladas solo ocho cepas provenientes de los gránulos AGK1, 2, 3, 5 y 6 coinciden con el perfil buscado. Como resultado de su secuenciación se obtuvo una homología de 98 a 100 % con Lb kefiranofaciens sub kefirgranum/kefiranofaciens. Si bien el análisis de la secuencia no permite diferenciar las dos subespecies la distancia relativa recorrida por ambas en los perfiles de DGGE marca una importante diferencia entre ambas. Del análisis de las cepas seleccionadas mediante viscosimetría rotacional se observa un comportamiento pseudoplástico con importantes áreas de histéresis. Los valores de viscosidad aparente a 300s-1 variaron entre 17,82 ± 1,05 y 35,96 ± 10,15 mPa.s y las áreas de histéresis entre 745,2 ± 35,64 y 1861 ± 613,77 Pa/s. Solo dos de las cepas presentan viscosidad equivalente a la cepa de referencia indicando que existe variabilidad en sus propiedades funcionales. Es importante destacar que es la primera vez que se aísla L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kéfir argentinos con potencialidad para su aplicación en desarrollos tecnológicos como en alimentos funcionales.