Unión de 1,8-ANS a YLSCP-2: comparación de técnicas calorimétricas y espectroscópicas

NOELIA I. BURGARDT; RAÚL G. FERREYRA; FEDERICO J. PÉREZ DE BERTI; BETINA CORSICO; MARIO R. ERMÁCORA; MARCELO R. CEOLÍN

Quilmes

Taller; Biofísica de Macromoléculas: aspectos estructurales e implicancias biológicas y biotecnológicas; 2007

Sociedad Argentina de Biofísica

YLSCP-2 es una proteína que une diversos tipos de moléculas hidrofóbicas. Para lograr una caracterización del sitio de unión de YLSCP2 estudiamos la unión de 1,8-ANS. En primera instancia seguimos la unión por cambios en la fluorescencia del 1,8-ANS, ajustamos ecuaciones de un sitio de unión a los datos experimentales y determinamos que la constante de disociación es 10-50 mM. Con los datos obtenidos diseñamos un ensayo de titulación isotérmica calorimétrica con el objetivo de obtener más información del evento de unión. Sorprendentemente, nos encontramos con una constante de disociación menor que la obtenida por fluorescencia cuando ajustamos ecuaciones de unión a sitios idénticos. El ensayo fue realizado con sus respectivos controles y el ajuste de las ecuaciones correspondientes nos devuelve una constante entre 0.3-0.6 mM, n~1 y DH de unión del orden de ?500 KJ/mol. Así mismo observamos que YLSCP-2 se encuentra como dímero en las condiciones de trabajo y realizamos los controles necesarios para determinar si esto podría estar influyendo en resultados de ITC. Estos controles demostraron que no hay una gran contribución de la dilución de YLSCP-2 sobre el calor liberado en la unión. Un modelo de la estructura de YLSCP-2 muestra que el sitio de unión estaría expuesto al solvente. Esto nos sugiere que tal vez el 1,8-ANS que se une en dicho sitio no presenta grandes cambios en sus propiedades fluorescentes por quedar expuesto al solvente. Además en trabajos anteriores mostramos que este ligando induce cambios en la estructura y estabilidad de la proteína. Con toda esta información buscamos explicar la diferencia encontrada entre ambas técnicas. Estos resultados constituyen la primera etapa del análisis sistemático del espectro de ligandos de YLSCP-2.