Caracterización cinética y estructural de la Fosforilcolina Fosfatasa de Pseudomonas aeruginosa

BEASONI PAOLA; PÉREZ DE BERTI FEDERICO JAVIER; RAÚL G. FERREYRA; SANTOS JAVIER; RISSO VALERIA; LISA A.T; DOMÉNECH CARLOS; MARIO R. ERMÁCORA

Quilmes

Taller; Biofísica de Macromoléculas: aspectos estructurales e implicancias biológicas y biotecnológicas; 2007

Sociedad Argentina de Biofísica

 Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista responsable de infecciones nosocomiales crónicas y agudas y representa un importante problema para pacientes con quemaduras severas, fibrosis quística, y enfermedades inmunocomprometedoras [1]. Nosotros hemos propuesto un mecanismo para explicar las infecciones pulmonares a través de la acción coordinada y secuencial de la fosfolipasa C hemolítica y la fosforilcolina fosfatasa (PchP). Es por esto, que la PchP (37 KDa aprox.) es un potencial blanco para evitar la acción patogénica de esta bacteria [3]. La enzima pertenece a la superfamilia de las deshalogenasas haloácidas (HAD), caracterizada por la presencia de tres motivos: I: 31DMDNT35, II: 166SAA168 y III: K242/261GDTPDSD267 [2]. El mecanismo catalítico involucra un ataque nucleofílico al enlace O-P del sustrato. Para catalizar la hidrólisis de la fosforilcolina, el Mg2+ es uno de los iones activadores de la PchP. Nosotros estamos interesados en la caracterización estructural de esta proteína. Por esta razón, la enzima recombinante fue expresada en E. coli y purificada de cuerpos de inclusión por una cromatografía de intercambio aniónico bajo condiciones desnatruralizantes. La proteína desnaturalizada en urea fue replegada por diálisis contra buffer tris en presencia y ausencia de Mg2+ 5 mM. En ambas condiciones la PchP replegada fue activa, pero con una muy diferente estructura terciaria. La enzima replegada con Mg2+ mostró una estabilidad térmica 20°C mayor que la PchP replegada sin Mg2+, y una mucho más alta resistencia a la digestión con tripsina. De hecho, la estructura terciaria de la PchP replegada sin Mg2+ fue modificada al agregarle este metal. Experimentos cinéticos indican que la PchP contiene dos sitios de interacción para la fosforilcolina y dos para el Mg2+, ambos con diferentes afinidades. El sitio de menor afinidad para el Mg2+ debe estar ocupado para evitar la inhibición causada por altas concentraciones de sustrato. Como consecuencia de estos hallazgos fuimos capaces de optimizar los experimentos de cristalización. La actividad fosfatasa fue medida utilizando un novedoso método desarrollado en nuestro laboratorio, el cual se basa en la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato. A altas concentraciones de enzima fue observado un incremento de la actividad específica, probablemente debido a un fenómeno de dimerización. La modificación química con glutaraldheído mostró que la PchP es una enzima dimérica sin importar que haya sido replegada en presencia o ausencia de Mg2+, y la dimerización es independiente del agregado de ligandos. Experimentos de dispersión de luz estático corroboran estos resultados.