Eficiencia de extracción y amplificación de ARN de frutos de mandarina mediante RT-PCR

DÍAZ, GABRIELA; BELLO, FERNANDO; PEGA, JUAN; GUIDI, SILVINA; NANNI, MARIANA

Congreso; XV Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de Alimentos; 2015

Asociación Argentina de Tecnólogos Alimentario (AATA)

La República Argentina es el octavo productor mundial de cítricos. Exporta frutas cítricas frescas, jugos y aceites esenciales desde 1970. La producción total en Argentina es de 2 millones de toneladas, siendo esta de excelente calidad y sanidad. Actualmente, la detección y caracterización de los ácidos nucléicos por técnicas de biología molecular son utilizadas para trazabilidad, autenticidad, así como para determinar calidad de los alimentos y sus procesos en general.El objetivo de este trabajo fue optimizar la extracción de ácidos nucléicos del flavedo de frutos de mandarina, con el fin de obtener ARN total de alto rendimiento y calidad para la amplificación, por la reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR). de una región del gen 18s y la evaluación de la expresión del gen de la sHSP19.1KD. Se utilizaron frutas de mandarina (Variedad Satsuma Okitsu), obtenidas del campo experimental del INTA Concordia.El ARN total se extrajo mediante el método desarrollado, a partir de 2-3 g. de muestra de flavedo de mandarina. Luego se trató con DNAse I, para la purificación de ARN. Posteriormente, el ARN total se cuantificó mediante fluorimetría según protocolo Quibit 2.0. A partir, de las muestras de ARN total purificado, fue realizada la retro-trascripción y amplificación por RT-PCR de las regiones 18S y sHSP 19.1KD. El método de desarrollado, fue el más eficiente para la obtención ARN en cantidad y calidad. A partir de los métodos utilizados y modificaciones introducidas se pudo optimizar la extracción de polisacáridos y polifenoles que pudieran interferir en la calidad y rendimiento del ARN. Se observa en la comparación, que el método de desarrollado,fue el más eficiente para la obtención ARN en cantidad y calidad. El software Image J, permitió observar las diferencias en la expresión del ARN de 18S y sHSP 19.1KD, obtenidos de la amplificación por RT-PCR de la muestra evaluada. El Ladder (100 pb) utilizado comprende fragmentos de ADN doble cadena desde 100 a 1000 pb con dos bandas adicionales de 1500 pb, y 2080 pb. Se sembró 5 µl, sabiendo que cada banda tiene aproximadamente 40 ng. excepto la banda de 500 pb que tiene 90 ng aproximadamente. Finalmente los resultados obtenidos demostraron la eficiencia de obtención de ARN mediante el método desarrollado, a partir de muestras de flavedo de citrus Clementina variedad Okitsu. La correcta amplificación de las secuencias para 18s y sHSP 19.1 KD permitirían generar una herramienta para la evaluación de fenómenos fisiológicos en pre y pos-cosecha de frutos de cítricos. Las actividades enmarcadas en el presente trabajo han sido financiadas por el PNAIyAV 1130043, proyecto institucional INTA 2013-2019 y PID de la Universidad de Morón 06/014 2014-2018.