Expresión de versiones recombinantes de glicoproteína D del HVBo-1 en larvas de lepidóptero y su evaluación como inmunógenos en tres modelos animales

STAFFORINI, GUILLERMINA; PEGA, JUAN FRANCO

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

Una versión recombinante de la glicoproteína D (gD) del Herpesvirus Bovino tipo 1 (HVBo-1) fue producida sola o fusionada a un anticuerpo de cadena única (APCH1) con afinidad al MHC clase II de bovinos. Ambas proteínas fueron expresadas en larvas del lepidóptero Trichoplusia ni, utilizando vectores derivados del baculovirus AcNPV. Para la expresión de gD como subunidad, el gen nativo fue clonado sin péptido señal ni secuencia de anclaje (gDc), dentro de un nuevo vector de transferencia (pFastMelB-his) desarrollado de forma de poder expresar la proteína portando el péptido señal de la melitina de abeja (gDm). La correcta expresión de los productos recombinantes fue confirmada por SDS-PAGE y Western blot usando anticuerpos (Ac) contra la secuencia de histidinas y contra la gD de HVBo-1. La concentración del producto recombinante fue estimada en ~800 µg/ml de extracto crudo de proteínas de la larva para gDm y en ~200 µg/ml para la fusión APCH1-gDc. Para los experimentos en ratón se formularon vacunas oleosas incluyendo diferentes cantidades de extracto crudo de proteínas de larvas expresando gDm. Los sueros de los animales inoculados fueron analizados por ELISA, mostrando en todos los grupos la inducción de altos títulos de Ac contra la gD luego de una única inoculación y hasta un año después de la misma. Para los experimentos en cobayos, 8 grupos de animales (n=5) recibieron 2 inoculaciones, a los 0 y 26 días, en formulaciones oleosas similares a las de ratón y conteniendo entre 30 ng y 300 µg de gDm por dosis. Los sueros fueron analizados hasta los 60 días post-primo vacunación (dpv), demostrando la inducción de Ac específicos contra la proteína recombinante y la partícula viral completa, siendo capaces de neutralizar la infección in vitro. Uno de los grupos experimentales (30 µg) mostró niveles de Ac específicos superiores a los de la vacuna comercial entre los 26 y 60 dpv, aunque sólo para los Ac específicos contra gD. Por último, se realizaron inmunizaciones en bovinos con extractos conteniendo gDm o APCH1-gDc, fusión que sería capaz de unirse a las proteínas del MHC tipo II de bovinos para así mejorar la eficiencia de su presentación antigénica. Grupos de animales (n=5) recibieron una vacuna comercial a virus inactivado o formulaciones oleosas conteniendo extractos crudos de larva expresando gDm, APCH1-gDc o un antígeno no relacionado. Para los grupos inoculados con los extractos de larva se efectuaron 3 inmunizaciones a los 0, 23 y 49 días, utilizando dosis de 200 µg para las dos primeras y de 800 µg para la tercera inoculación. Se tomaron muestras de suero a los 0, 23, 34, 49, 70 y 110 dpv. Las vacunas con extractos de larvas conteniendo gDm o APCH1-gDc produjeron mayores títulos de Ac contra gD que la vacuna comercial en todos los tiempos, siendo los de APCH1-gDc ligeramente superiores a los de gDm. Sin embargo, tal lo observado en cobayos, estos títulos eran menores que los de la vacuna comercial cuando los sueros se analizaban contra la partícula viral completa, ya sea por ELISA o en ensayos de seroneutralización, estando en todos los casos por debajo de los niveles considerados protectivos. Estos resultados indicarían que si bien gDm y APCH1-gDc son expresados en buenas concentraciones en las larvas infectadas y presentan gran capacidad inmunogénica, otros factores relacionados con los procesos de extracción o procesamiento dentro de la larva pueden afectar la inducción de mayores niveles de anticuerpos que reconozcan las formas nativas de la gD y permitan la neutralización de la infección por el HVBo-1.