Actividad antioxidante in vivo de la micosporina-glutaminol-glucósido en la levadura Phaffia rhodozyma

PAJAROLA A. L.; LIBKIND D. Y MOLINÉ M.

S. C. de Bariloche

Congreso; IV Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos; 2018

IPATEC, CONICET- Universidad Nacional del Comahue

Las levaduras cuentan con distintas estrategias fotoprotectoras y antioxidantes que les permiten sobrevivir en ambientes con alta incidencia de radiación ultravioleta. Entre estas estrategias se destaca la producción y acumulación de la molécula micosporina-glutaminol-glucósido (MGG). Esta molécula ejerce actividad fotoprotectora contra la RUV-B, evitando el daño directo sobre el ADN y ejerce quenching in vitro contra el oxígeno singulete. Sin embargo, la evidencia de su rol antioxidante in vivo en levaduras es escasa, y aún es necesario establecer de qué modo y contra qué ROS protegen las micosporinas evaluando el tipo de daño que evitan. El objetivo de este trabajo es caracterizar la actividad antioxidante in vivo de la MGG en la levadura Phaffia rhodozyma utilizando dos métodos de screening de estrés oxidativo intracelular (peroxidación lipídica y DCFDA).Para ello se utilizaron tres cepas de P. rhodozyma: la cepa tipo UCD 67-385; una mutante hiperproductora de MGG (MUT 7918) y una mutante deficiente para la producción de MGG, Δ-3genes. Las cepas se cultivaron en medio líquido MMS durante 120 hs (máxima acumulación de MGG). Se tomaron alícuotas de los cultivos y se expusieron a los siguientes tratamientos con ROS: peróxido de hidrógeno, anión superóxido (generado por adición de duroquinona, DQ), oxígeno singulete (generado mediante rosa de bengala RB y radiación PAR) y radical hidroxilo (generado por reacción de Fenton). Se realizaron curvas de supervivencia a distintas concentraciones y tiempos de exposición a las ROS. Los puntos en los cuales se determinaron las mayores diferencias en la supervivencia de las distintas cepas fueron utilizados para realizar un screening del estrés oxidativo intracelular a través de la cuantificación de los lípidos peroxidados con el método TBARS1, y a través de la fluorescencia de la molécula DCFDA2. Se encontró que la cepa hiperproductora de MGG presentó la mayor supervivencia al estrés inducido por H2O2 y radical hidroxilo (superior al 60%) mientras que la cepa deficiente para la producción de MGG, Δ-3genes, presentó supervivencias menores al 10%. El método de peroxidación lipídica mostró resultados similares. No se observaron diferencias en la cantidad de lípidos peroxidados para los tratamientos con RB y DQ, pero sí se observaron para H2O2 y para Fenton en las tres cepas. Sin embargo, esas diferencias fueron dos veces mayores en la cepa deficiente para la producción de MGG, Δ-3genes. Finalmente el método de screening de estrés oxidativo con DCFDA mostró un incremento en la cantidad de células fluorescentes (estrés intracelular) para todos los tratamientos en la cepa deficiente para la producción de MGG, respecto de su cepa parental. Los resultados obtenidos hasta el momento indican que la MGG ejerce un rol antioxidante in vivo contra el H2O2 y el radical hidroxilo y uno de sus mecanismos de acción podría estar implicado en la inhibición de la peroxidación lipídica. Se realizarán ensayos in vitro e in vivo adicionales incorporando nuevas cepas y especies reactivas de oxígeno.