Aislamiento y Caracterización de un Gen de Resistencia a Microcina J25 en escherichia coli

PAZ GARCÍA ENRIQUE; SOCÍAS, SERGIO B.; SALOMÓN, RAÚL

San Miguel de Tucumán

Congreso; V Jornadas de Jovenes Investigadores UNT (AUGM); 2012

Asociación de Universidades del Grupo Montevideo (AUGM) - Universidad Nacional de Tucumán

En este trabajo se logró, mediante una técnica de clonado in vivo, aislar un fragmento de ADN cromosómico de Escherichia coli que otorga resistencia parcial al péptido antibiótico microcina J25 (MccJ25). El procedimiento se realizó en una cepa con una deleción del gen yojI, para evitar el clonado de este gen, del que ya sabíamos que confiere resistencia al antibiótico. A fin de identificar el gen o genes responsables del fenotipo de resistencia, se realizó una PCR con el plásmido recombinante, designado pEG109X5, para comprobar la ausencia del gen ydiE, otro gen ya conocido que induce resistencia a MccJ25. La ausencia de este gen indicó la presencia de un nuevo determinante de resistencia. El plásmido pEG109X5 se digirió con HindIII y se subclonaron los fragmentos resultantes en el vector pACYC177. Uno de los plásmidos recombinantes, designado pACAX521, confirió resistencia parcial a MccJ25 al ser transformado en cepas sensibles y fue elegido para su posterior caracterización. Los extremos del fragmento cromosómico insertado en este plásmido se secuenciaron, y con esta información se hizo una comparación con el genoma de E. coli. Se determinó así que el inserto en pACAX521 está localizado en la región del minuto 41 del cromosoma de E. coli, donde se localizan, entre otros, un conjunto de genes que codifican para la importación de zinc extracelular. Conociendo el mapa físico del segmento, se digirió pACAX521 con EcoRV, y se subclonaron los fragmentos producidos en el sitio EcoRV de pACYC184. La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa DH5α. La resistencia a MccJ25 fue recuperada en un clon, denominado pAC521E, el cual contenía un fragmento de ADN en el que sólo se encontraban los genes del metabolismo del zinc. Ninguno de ellos ha sido relacionado previamente con resistencia a la MccJ25, confirmando que se trataba de un nuevo mecanismo de resistencia a este antibiótico. Nuestros resultados demuestran que esta resistencia no se debe al bombeo activo de la MccJ25 entrante al medio extracelular ni a un ingreso disminuído del antibiótico a la célula. Existe la posibilidad de que este fenotipo sea una consecuencia del aumento de la concentración intracelular de zinc, lo cual aliviaría el estrés oxidativo que, según ya conocemos, produce la MccJ25 en las células sensibles.