Produccion de Cazymas recombinants en Lactococcus lactis para mejorar la calidad de ensilados

GIZZI, F; MARTIN, M; MAGNI, C; BLANCATO, VS

Rosario

Jornada; II Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FbioyF; 2023

Facultad de Cs Bioquimicas y Farmacéuticas

Introducción: Una de las bacterias ácido lácticas (BAL) más comunes utilizadas en la fabricación de alimentos es Lactococcus lactis, generalmente considerada como segura (GRAS). Su incorporación en procedimientos biotecnológicos sumado a su capacidad para la producción de enzimas recombinantes podría mejorar procesos de la industria ganadera. La fermentación de forrajes mediante la técnica de ensilado es crucial para la agroindustria y la sociedad, debido a que los rumiantes pueden producir carne y leche a partir de biomasa vegetal que no es apta para el consumo humano. Los principales componentes de las paredes celulares vegetales que constituyen los forrajes incluyen celulosa, lignina y hemicelulosa (principalmente formada por xilano), esta es hidrolizada por enzimas llamadas xilanasas (EC 3.2.1.8) presentes en muchos hongos, levaduras y bacterias1. El objetivo principal de este estudio es incrementar la actividad xilanasa en el ensilaje para mejorar la digestibilidad de la biomasa vegetal en rumiantes. Esto se logrará mediante la expresión de la enzima recombinante en L. lactis. El objetivo final es proporcionar una estrategia rentable y sostenible para mejorar el valor nutricional del ensilaje, lo que podría aumentar la productividad animal y mejorar la eficiencia alimentaria2.Resultados: En nuestro laboratorio, se sobre expresó el gen xynA de Bacillus subtilis en L. lactis NZ9000, se purificó y caracterizó la enzima, presentando una temperatura óptima de 40°C, además su actividad máxima se encontró entre pH 5 y 6. Los valores de V máx., coeficiente de Hill y S0.5 de la proteína purificada fueron de 77.02 UI/mg, 1.67 y 1.77 g/L, respectivamente. En este trabajo, continuamos la caracterización de la proteína Bsxyn11A analizando su actividad en sustratos vegetales. Para ello, la enzima purificada y el sobrenadante de cultivo de BAL portadores de los plásmidos pNZ-xynA o pNZ (control negativo) se incubaron con xilano o sorgo triturado en un buffer fosfato de sodio durante 24 horas a 37°C. Posteriormente, se realizó un análisis de cromatografía en capa delgada (TLC) para visualizar los xilooligosacáridos generados por la actividad de la enzima.Observamos que la enzima purificada actuó sobre el sustrato xilano como se esperaba, produciendo varios oligómeros, excepto el monómero X1, lo cual es consistente con las propiedades de familia 11 de glicosilasas (GH11) coincidiendo además con resultados previos. Así también, los sobrenadantes de cultivo de BAL que expresaban Bsxyn11A fueron capaces de degradar xilano puro. Luego, la enzima Bsxyn11A purificada se incubó con sorgo triturado: en el análisis de TLC pudimos observar señales diferenciales entre el sustrato tratado con enzima y el no tratado. También, cuando el sorgo se incubó con sobrenadantes de cultivo de control o sobrenadantes que expresaban Bsxyn11A, observamos modificaciones en las manchas visibles. Por lo tanto, la enzima produjo cambios en el patrón de carbohidratos observables mediante TLC.Conclusión: Los resultados presentados indican que la xilanasa recombinante producida en L. lactis es capaz de degradar carbohidratos presentes tanto en el sorgo como en el xilano. Se necesitan más estudios para optimizar las condiciones de incubación e identificar los carbohidratos producidos. Con base en estos resultados, concluimos que la xilanasa secretada por L. lactis recombinante es un buen candidato para mejorar la fermentación del ensilaje.Referencias: 1) Subramaniyan, S. et al. Critical Reviews in Biotechnology. (2002) 2) Kraut-Cohen, J. et al. Applied Microbiology and Biotechnology (2016).