EVALUACIÓN IN VITRO DE LA MIOGENESIS LUEGO DE LA INTOXICACIÓN CON UNA FOSFOLIPASA A2

LEIVA, LAURA; FUSCO, LUCIANO; MATZNER, VERÓNICA; BUSTILLO, SOLEDAD

Corrientes

Jornada; XXII Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2016; 2016

UNNE

La capacidad regenerativa del tejido muscular está relacionada con la presencia de las células satélite las que permanecen quiescentes en laperiferia de las fibras musculares hasta que estas sufren un daño. En ese momento, se activan y dividen generando mioblastos, los cuales proliferany se fusionan para formar miotubos hasta reconstituir las fibras musculares.Los mioblastos en cultivo son comparables a las células satélites en la fibra muscular y son capaces de exhibir todas las características de lamiogénesis muscular. La mayoría de los accidentes ofídicos en nuestro país son causados por Bothrops diporus (yarará chica), serpiente de interésen el presente estudio. No se ha investigado previamente el rol de las principales toxinas de este veneno en la regeneración muscular luego de laintoxicación ofídica. Así, el objetivo de este trabajo es el estudio en la inhibición de la regeneración muscular de una fosfolipasa A2 básica (PLA2) aisladadel veneno de Bothrops diporus, para así avanzar en el conocimiento y elucidación del mecanismo puesto en juego durante la intoxicación. Para ello, enprimer lugar se purificó la enzima mediante dos etapas cromatográficas, una cromatografía de intercambio iónico (Sulfopropil-celulosa, 35 mg deveneno-buffer Tris-HCl 20 mM, pH 7/NaCl 0.5M) y la segunda una cromatografía de filtración molecular Sephadex G75 (Tris-HC1 20 mM, pH7). Los ratones (CF-1) fueron inyectados en el músculo gastrocnemio derecho con 25 μg de la enzima PLA2. Los animales utilizados como controlfueron inyectados con buffer fosfato salino (PBS). Luego de diferentes intervalos de tiempo (1, 3, 24 y 168 h), fueron sacrificados, los músculosfueron diseccionados y colocados en un mortero con N2 líquido para su congelación y pulverización a finas partículas. Se preparó un pool con todos losmúsculos correspondientes al mismo tratamiento. La cuantificación de la cantidad de veneno presente en cada muestra de homogenato fue realizadopor ensayo de ELISA. Luego, para evaluar el efecto de los homogenatos en la miogénesis, se adicionaron 25-30 μg de proteína de los homogenatosmusculares obtenidos de ratones inyectados con PLA2 disueltos en el medio de cultivo (DMEM-GIBCO) suplementado con solo 1% de SFB y se dejó24hs a 37ºC-5% CO2. Los eventos morfológicos y daños celulares inducidos, se analizaron cualitativamente por microscopía de contraste de fases.Los resultados obtenidos evidenciaron la presencia de la enzima PLA2 en los homogenatos de músculos de ratones tratados, hasta 24h postinoculación.Se detectó un 30% de PLA2 pasada una hora de la inoculación que luego disminuyó a un 10% y 2% a las 3 h y 24 h respectivamente. No sedetectó presencia de la toxina luego de 7 días de realizada la inoculación. En la evaluación de la miogénesis, se comprobó una inhibición completa de lafusión de los mioblastos para formar miotúbulos en los ensayos realizados con homogenatos obtenidos luego de 1 h de la inoculación. Así también, loshomogenatos correspondientes a 3 h inhibieron en gran parte la formación de miotúbulos observándose áreas donde predominaron las formasindiferenciadas. No se evidenciaron cambios con los homogenatos correspondientes a las 24 h ni con los de 168 h. Si bien se detectó prsencia dePLA2 luego de 24 h, probablemente la baja concentración presente de la toxina, no es suficiente como para evidenciar un efecto in vitro de inhibición dela miogénesis. En conclusión, estos hallazgos sugieren que trazas de la enzima PLA2 presentes en el tejido muscular luego de varias horas de laintoxicación, impedirían una respuesta regenerativa exitosa. Futuros estudios de neutralización pondrán en evidencia si es posible una administraciónlocal de antiveneno o anticuerpos específicos para uso terapéutico.