Expresión recombinante, purificación y caracterización de una isoforma resistente de la enzima acetolactato sintasa de Amaranthus palmeri

PEROTTI VALERIA E; PALMIERI VALERIA; PERMINGEAT HUGO R

Rosario

Congreso; II Congreso Argentino de Malezas ASACIM; 2018

ASACIM

La enzima acetolactato sintasa (ALS) cataliza el primer paso en la biosíntesis de aminoácidos alifáticos de cadena lateral ramificada en plantas,constituyendo el blanco de acción de los herbicidas del grupo B. En Amaranthus palmeri, la mayoría de los casos de resistencia a inhibidores ALS responden a un mecanismo target (debido a mutaciones en la secuencia codificante del gen als). En una subpoblación de A. palmeri hallada en Totoras, con resistencia cruzada a inhibidores ALS, se hallaron 6 versiones alélicas de la enzima ALS (conteniendo las sustituciones A122S, A205V, A282D, D376E, W576L, S653N). Así, el presente trabajo tiene como objetivo dilucidar el grado de responsabilidad de las sustituciones novedosas halladas (A122S y A282D) en el fenotipo de resistencia mediante la obtención de las respectivas isoformas recombinantes y su posterior evaluación funcional en presencia de los herbicidas. Las versiones mutantes (M122 y M282) y wild-type (WT) del gen als de A. palmeri fueron clonadas en el vector de expresión pET32a y expresadas en E. coli BL21 (DE3) Codon plus. Las tres proteínas fueron purificadas por cromatografía de afinidad utilizando columnas de níquel-agarosa. La actividad enzimática de cada proteína recombinante fue determinada midiendo la cantidad de acetoína formada en presencia de diferentes concentraciones de imazetapir, diclosulam y clorimurón-etil. Las enzimas purificadas aparecen como una única banda en el SDS/PAGE con una masa molecular de 91 kDa. Los Índices de Resistencia obtenidos a partir de los I50 de las versiones M122 y M282 versus la WT fueron 17 y 1,4 para imazetapir; 18 y 1,5 para diclosulam y >15 y 0,3 para clorimurón-etil, respectivamente. De este modo, los resultados obtenidos confirman que la sustitución A122S confiere resistencia a estos tres herbicidas. Curiosamente, la sustitución A122S sólo se ha informado en levaduras hasta el momento, siendo éste el primer reporte de la misma en plantas.