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Desarrollo de matrices de adsorción poliméricas para la purificación de Lisozima a partir de su fuente naturalJulia Bottai, M.E. Brassesco, G. PicóInstituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos. CONICET. Universidad Nacional de Rosario. Suipacha 570 (S2002RLK) Rosario. Argentina.*brassesco@conicet-iprobyq.gob.arResumen Se prepararon matrices de Alginato 0.6% (p/V), Goma Guar 0.5% (p/V) y tres polímeros sintéticos diferentes con el objetivo de mejorar la capacidad de recupero de la Lisozima desde la clara de huevo. Se determinó la concentración óptima de cada polímero analizando la capacidad de adsorción de la enzima en cada una de las matrices. Una vez determinada la concentración óptima final de 0.2% (p/V) para los tres polímeros, se realizó un análisis cinético y de isotermas, a partir del cual se seleccionó el alcohol polivinílico ya que se obtuvo un qmáx = 2.7 mg/g de matriz. Finalmente, luego de determinar la mejor condición de desorción con el aumento de la fuerza iónica del medio por el agregado de NaCl 0.3 M, se llevó a cabo un ciclo de adsorción-lavado-desorción, observándose una mejor purificación de la lisozima a partir de su fuente natural cuando se utiliza la matriz Alginato-Goma Guar-Polivinilalcohol entrecruzada con epiclorohidrina.Palabras ClavesPolímeros; lisozima; adsorción; isotermas; purificación.1.IntroducciónLa adsorción es una operación unitaria valiosa para aislar, concentrar y purificar proteínas. El uso de polímeros naturales, como polisacáridos, para obtener matrices con la capacidad de adsorber proteínas es una excelente opción ya que son fáciles de preparar a gran escala, rentables y pueden ser descartados al medio ambiente sin ningún impacto negativo. Sin embargo, cuando se desea adsorber una molécula desde su fuente natural, esta última produce una interferencia en el proceso de adsorción. Se ha demostrado que el agregado de un polímero de cadena flexible no iónico (PCF) puede evitar la interacción con la biomasa aumentando el rendimiento del proceso de purificación. Por lo tanto, se llevó a cabo la producción de matrices de Alginato y Goma Guar (Alg-GG) entrecruzadas con epiclorohidrina (Epi), adicionándole diferentes relaciones de los siguientes PCFs: Pluronic® F68 (P68), polivinilpirrolidona (PVP) y alcohol polivinílico (PVA). Se estudió la influencia de estos PCFs en la adsorción de lisozima (LZ) en cada matriz, determinando el mecanismo molecular por el que este proceso se lleva a cabo. Finalmente, en base a los resultados obtenidos se procedió a la purificación de la LZ a partir de la clara de huevo.2.MetodologíaLas matrices se prepararon por gelificación ionotrópica, goteando en CaCl2 0,1 M una solución de Alg 0,6% (p/V), GG 0,5% (p/V) y los distintos PCF, variando la concentración final de cada uno de éstos en 0 % (p/V), 0.2% (p/V), 0.4% (p/V) y 0.6% (p/V). Las mismas fueron tratadas con Epi para unir covalentemente sus cadenas polisacáridas. Se estudió la capacidad de adsorción en cada matriz, utilizando condiciones de pH y T (ºC) ya optimizadas, y se obtuvieron las isotermas y cinéticas de adsorción en lecho agitado. Una vez seleccionada la matriz con mejor capacidad de adsorción de LZ, se estudió la mejor condición para su desorción. Finalmente, se aplicaron todas las condiciones estudiadas en la recuperación de LZ desde su fuente natural, la clara de huevo. Se llevó a cabo un ciclo de adsorción-lavado-desorción, y cada etapa fue evaluada realizándose una electroforesis SDS-PAGE.3.Resultados y DiscusiónLa capacidad de adsorción de LZ en cada una de las matrices obtenidas relacionando la concentración final de cada PCF y el diámetro de la esfera obtenida fue estudiado (Figura 1). La condición de trabajo de buffer fosfato 20 mM pH 7 fue determinada previamente. Se observó que al agregar cada uno de los PCF para la formación de la matriz, el tamaño de la partícula disminuye con respecto a la matriz formada sólo por Alg-GG. Sin embargo, no se ve prácticamente variación de tamaño entre las diferentes concentraciones finales de cada PCF. El mayor porcentaje de adsorción se observó en las matrices formadas por Alg-GG-PCF 0.2% (p/V), obteniéndose el máximo de 60% con el agregado de PVA 0.2% (p/V). Se estudió además el comportamiento cinético e isotermas de cada una de las matrices (Figuras 2 y 3). El análisis estadístico de la función de error mostró que todos los sistemas ajustan a los modelos de pseudo primer orden y Freundlich (datos no mostrados), lo que confirma un tiempo de adsorción de 40 minutos y un proceso de adsorción multicapa con interacción entre las moléculas adsorbidas con un qmáx= 2.7 mg/g para la matriz Alg-GG-PVA. Por los resultados obtenidos, se escogió la matriz Alg-GG-PVA 0.2% (p/V) para continuar trabajando. Se determinó que la mejor condición para la desorción de LZ era utilizar medio buffer fosfato 20mM pH 7 con agregado de NaCl 0.3 M, obteniéndose porcentajes de desorción finales de hasta 80%. Finalmente, se llevó a cabo un ciclo de adsorción, lavado y desorción de la clara de huevo en las condiciones previamente estudiadas y se comparó la purificación de la enzima de interés entre la matriz Alg-GG y Alg-GG-PVA. La figura 4 muestra la electroforesis SDS-PAGE, donde se observa un mejor recupero de la LZ en la matriz Alg-GG-PVA con respecto a la de Alg-GG, verificando el mejoramiento en la capacidad de purificación enzimática a partir de su fuente natural con el agregado de PVA.4.ConclusionesEl agregado de un PCF a una matriz de Alg-GG entrecruzada con epiclorohidrina muestra una mejor capacidad de adsorción de LZ con respecto a una matriz formada sólo por Alg-GG. La adsorción ? desorción en una matriz Alg-GG-PVA mostró ser eficaz para la purificación de LZ a partir de su fuente natural, siendo económica, no contaminante y aplicable a nivel industrial.Tablas, gráficos e imágenes 5.BibliografíaBrassesco, M.E., Woitovich Valetti, Nadia, Picó, Guillermo (2017). Molecular mechanism of lysozyme adsorption onto chemically modified alginate guar gum matrix. International journal of biological macromolecules. 96, 111-117.Brassesco, M.E., Woitovich Valetti, Nadia, Picó, Guillermo (2018). Control of the adsorption properties of alginate - guar gum matrix functionalized with Epichlorohydrin through the addition of different flexible chain polymers as toll for the chymotrypsinogen isolation. International journal of biological macromolecules. doi:10.1016/j.ijbiomac.2018.04.087.Vennapusa, R.R. and M. Fernandez-Lahore (2010). Effect of chemical additives on biomass deposition onto beaded adsorbents. Journal of bioscience and bioengineering. 110(5), 564-571.EJE TEMATICO: Procesos de recuperación y purificación de macromoléculas.