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Aislamiento de endoglucanasa de cultivo fúngico a través de la adsorción sobre matrices poliméricas.María Julia Boggione, Paula Zilli, Beatriz Farruggia.Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos (IPROByQ) CONICET. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. U.N.R. Suipacha 570. Rosario. Argentina.bfarrug@fbioyf.unr.edu.arResumen La utilización de matrices poliméricas insolubles como adsorbentes enzimáticos es una técnica que permite la retención específica de enzimas provenientes de un extracto natural de composición compleja de modo rápido y económico. Con el objeto de aislar endoglucanasa proveniente de un cultivo de Aspergillus niger producido en medio sólido, se desarrollaron cuatro tipos de matrices poliméricas (quitosán, quitosán entrecruzado con glutaraldehído, quitosán-eudragit y alginato- goma arábiga), éstas fueron caracterizadas y se estudió la cinética de adsorción y desorción del caldo de cultivo sobre ellas calculando el factor de purificación y el porcentaje de rendimiento de endoglucanasa respecto del caldo original. La purificación con las matrices de quitosán entrecruzado con glutaraldehido fue de 8.9 veces y presentó bajo porcentaje de rendimiento y cuando se utilizaron las matrices de quitosán-eudragit se obtuvo un rendimiento del 60 % y un factor de purificación de 2. Palabras clave Endoglucanasa; matrices poliméricas; adsorción.1. Introducción La obtención de un producto a partir de un cultivo, una vez finalizado, en las condiciones de pureza y actividad deseadas demanda el desarrollo de tecnologías bioseparativas que contemplen el menor número posible de pasos que sean fácilmente escalables, no contaminantes y económicas. Estas operaciones unitarias tienen como objetivo concentrar la enzima de interés, eliminar la mayor cantidad de impurezas y subproductos y, en la medida de lo posible, reducir el volumen en el que se encuentra la muestra. La utilización de matrices poliméricas insolubles como adsorbentes enzimáticos es una técnica que permite la retención específica de enzimas provenientes de un extracto natural de composición compleja de modo rápido y económico (Nakanishi et. al, 2001). Posee la ventaja de poder emplear polímeros de cadena flexible naturales que no impactan negativamente en el medio ambiente. Esta técnica reemplaza varios pasos extractivos tradicionales lo que permite disminuir costos de producción. El objetivo de este trabajo es desarrollar una metodología bioseparativa no contaminante, rápida y económica basada en procesos de adsorción-desorción empleando matrices formadas por polielectrolitos que permita recuperar endoglucanasa proveniente de caldos de cultivos fúngicos en medio sólido.2. MetodologíaLa producción enzimática se llevó a cabo por inoculación de esporas de una cepa de Aspergillus niger NRRL3 sobre residuos de la cosecha de soja en un medio de cultivo conveniente. Las medidas de actividad enzimática se realizaron por un método colorimétrico basado en la detección de azúcares reductores producidos por la hidrólisis enzimática de carboximetilcelulosa (CMC) (Miller, 1959). El método utilizado para cuantificar las proteínas fue el descrito por Warburg (Warburg& Christian, 1942).Fueron preparadas 4 tipos de matrices esféricas de quitosán (CHI), quitosán entrecruzado con glutaraldehido (CHI-Glu), quitosán- eudragit EPO (CHI-Eu), y de alginato- goma arábiga (Alg-GA). Se caracterizaron por titulación ácido base y por microscopía electrónica de barrido (SEM).La cinética de adsorción de la enzima endoglucanasa sobre las diferentes matrices se llevó a cabo colocando en contacto el extracto enzimático con una cantidad conocida de matriz y con agitación orbital constante, retirando muestras a los diferentes tiempos durante 120 minutos para las determinaciones de proteínas y enzima. Las matrices fueron lavadas con agua destilada bajo agitación y luego sometidas a la desorción de la enzima por efecto del aumento de la fuerza iónica del medio (NaCl 250 mM) midiéndose proteínas totales y actividad enzimática en el sobrenadante a distintos tiempos fijos (desde 15 hasta 120 min) en agitación orbital constante a 120 rpm. Se realizaron los blancos sin sustrato para cada uno de los tiempos determinados y el blanco sin enzima. Fueron calculados el factor de purificación (FP) y el rendimiento (%R) para cada etapa del proceso.3. Resultadosy DiscusiónRespecto de la caracterización de las matrices; a partir de la titulación de las matrices no se encontraron diferencias significativas entre los rangos de pI, el pK se observa entre 6 y 6,5 para todas matrices estudiadas. La curva de titulación de la matriz CHI-Glu es la que más difiere de la curva de la de CHI. El pK de las matrices coincide con el que pH utilizado en las adsorciones, lo que indica que las mismas se llevan a cabo sobre matrices no cargadas. A ese pH la enzima está por encima de su punto isoeléctrico. A través de las SEM se observa que la matriz de CHS muestra una textura de superficie lisa y no porosa. Por el contrario, en la superficie de las matrices de CHS-GLu (con 30 min de entrecruzamiento) y CHS-Eu se pueden apreciar estrías lo cual aumenta la rugosidad e irregularidad. Los resultados de la SEM indican que la matriz de CHS fue modificada químicamente, el aumento de rugosidad en el resto de las matrices podría contribuir a aumentar la adsorción de biomoléculas.Respecto de la cinética de las adsorciones; primero fueron determinadas las condiciones óptimas de relación matriz ? proteína. Trabajando con cantidades constantes de matriz de CHI (1 g de matriz en 10 mL) y diferentes concentraciones de un liofilizado comercial (Ly) de endoglucanasa (2.7 y 4.5 mg/mL). Los resultados indican que los mayores porcentajes de adsorción (23% de endoglucanasa a los 30 min) se obtienen con la mayor relación de Ly/CHI. También para las matrices de CHI-Glu se evaluó cual era el mejor tiempo de entrecruzamiento para el desarrollo de las matrices de trabajo posteriores y resultó ser la mejor la de CHI-Glu con 30 min de entrecruzamiento (adsorbe un 47% de endoglucanasa) frente a las de 10 y 60 min de entrecruzamiento.Aplicando el proceso de adsorción, lavado y desorción con la enzima proveniente del caldo de cultivo sobre las matrices de CHI y Alg-GA no se observaron valores de FP y %R convenientes para un futuro trabajo de aislamiento enzimático. Los mejores resultados fueron obtenidos para las matrices de CHI-Glu y CHI-Eu. Con la primera se obtuvo un factor de purificación de 8.9 con rendimiento del 30 % para 90 min de desorción y con la matriz CHI-Eu se obtuvo un FP de 2 y 60 %R con desorción de 120 min. En futuros trabajos se determinará el tipo de interacción matriz-enzima a través de la realización de las isotermas de adsorción para los equilibrios de adsorción de la endoglucanasa a las matrices de CHI-Glu y CHI-Eu. Ya ha sido determinado por el presente trabajo cinético que los tiempos óptimos de adsorción para dicho estudio de equilibrio es de 90 min. 4. ConclusionesLas matrices de quitosán modificadas químicamente con Glutaraldehido y con Eudragit son las que proporcionan la capacidad de ser utilizadas en el aislamiento de la endoglucanasa desde caldos de cultivos fúngicos. 5. Bibliografía Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem., 31, 426-428.Nakanishi, K., Sakiyama, T., Imamura, K. (2001). On the adsorption of proteins on solid surfaces, a common but very complicated phenomenon, J. Biosci. Bioeng. 91, 233?244.Warburg, O., Christian, W., (1942). Isolation and crystallization of enolase. Biochem. Z, 310, 384-421.6. AgradecimientosEste trabajo está soportado por CONICET, PIP 0578/12.EJE TEMATICO: Procesos de recuperación y purificación de macromoléculas