Análisis espectroscópico de endoglucanasa en distintos medios

BOGGIONE MARÍA JULIA; MIHOVILCEVIC DAMILA; BISCARI LUCÍA; BASSANI GEORGINA; RODRÍGUEZ FERNANDA; FARRUGGIA BEATRIZ

Buenos Aires

Congreso; XIX Congreso Argentino de Fisicoquímica; 2015

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

Análisis espectroscópico de endoglucanasa en distintos mediosMaría Julia Boggione;Damila Mihovilcevic; Lucía Biscari; Georgina Bassani; FernandaRodriguez; BeatrizFarruggiaIPROByQ. Dpto deQuímica-Física, Fac. de Cs Bioquímicas y Farmacéuticas. UNRbfarrug@fbioyf.unr.edu.arLa hidrólisis de celulosaes llevada a cabo por un complejo enzimático formado porendoglucanasas,exoglucanasas y β-glucosidasas. Uno de los organismos capaz dedegradar celulosa es Aspergillusniger. La utilización de enzimas en la industria estálimitada por sus procesosde producción y purificación siendo necesario el desarrollode métodos económicos yeficientes que permitan obtener grandes cantidades deenzimas a bajo costo(Downstream process). En nuestro grupo hemos desarrollado unprotocolo de purificaciónde endoglucanasa de A. niger utilizandoel polímero naturalchitosan. Bajo ciertascondiciones, el chitosan y la endoglucanasa forman un complejoinsoluble que puede serseparado fácilmente por centrifugación o decantación paraluego ser redisueltocambiando el pH o la fuerza iónica. Dado que durante esteproceso de purificación seutilizan diferentes pHs es necesario evaluar su efecto en laestabilidad enzimática yestructural de la endoglucanasa. El objetivo de este trabajofue estudiar el efecto delpH sobre la actividad y estructura de la endoglucanasautilizando técnicasespectroscópicas. La extinción de fluorescencia aporta informaciónacerca de la accesibilidaddel extintor al fluoróforo como también de cualquier cambioque ocurra en elmicroentorno del triptófano (Lakowicz, 1983). Se determinó laextinción de lafluorescencia de la endoglucanasa con acrilamida a distintos pHs: 3; 4;5,3 y 6. Los datos seajustaron con la ecuación de Stern Volmer a partir de la cual secalculó la constante deStern Volmer (KD). Se obtuvieron valores similares para todoslos pHs analizados salvopara pH 6 donde el valor de KD fuemayor, indicando unamayor accesibilidad de laacrilamida al residuo triptófano de la proteína. Esto último secorrobora al analizar losespectros de emisión de fluorescencia de triptófano. Laperturbación de laestructura secundaria de la endoglucanasa llevada a cabo medianteespectroscopía dedicroismo circular (DC) se evaluó a través del contenido de láminabeta (Fasman, 1996). Solose observó una disminución del contenido de estructurasecundaria a pH 6. Ademásse determinó la actividad enzimática empleandocarboximetil celulosa(CMC) como sustrato (Miller, 1959) preincubando laendoglucanasa a distintostiempos y pHs. No se observó una diferencia significativacuando la enzima fuepreincubada a los distintos pHs estudiados. Podemos concluirque en el rango de pHanalizado la enzima es menos estable a pH 6 sin embargo estecambio estructural esreversible dado que la actividad enzimática no se altera cuandola enzima es preincubada apH 6. Por lo tanto, se pueden utilizar pHs entre 3 y 6 parael desarrollo de procesosde purificación alternativos simples, económicos y escalablespara recuperar laendoglucanasa a partir de sus fuentes naturales como por ejemploun cultivo de A.niger.Fasman G. D. (1996) Circular dichroism and theconformational analysis of biomolecules. Plenum Press NY.Lakowicz J.R. (1983) Principles ofFluorescence Spectroscopy. Plenum Press NY.Miller G. L. (1959) Use of Dinitrosalicylicacid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31 (3),426-428.