Las hidrofobinas como proteínas de fusión para la recuperación in situ de proteína recombinante en cultivo de Pichia pastoris.

CEREZO, JULIETA; SMITH, MARÍA EMILIA; JULIÁN RODRÍGUEZ TALOU

Simposio; V Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2018

Introducción.El objetivo del presente trabajo es presentar una estrategia integrada producción, purificación e inmovilización de un antígeno del virus del Dengue (VD) para el diseño de un kit diagnóstico. Para esto se expresó el dominio III consenso de la proteína E del VD fusionado a hidrofobinas para su purificación en sistemas de dos fases acuosas e inmovilización directa por adsorción del producto purificado en placas multiwell usadas normalmente en técnicas de ELISA. La estrategia integrada se mejoró por la remoción in situ de la proteína de fusión durante el proceso de cultivo de la levadura, Pichia pastoris. El Dominio III consenso ha sido descripto recientemente basándose en el DomIII de la proteína E de distintas variedades de cada serotipo de todo el mundo, la cual demostró capacidad de generar una respuesta inmune contra todos los serotipos, por lo que es candidata a ser un antígeno vacunal contra el virus del dengue. Las hidrofobinas son proteínas anfifílicas de entre 7,5 ? 10 kDa, producidas por hongos filamentosos. Se ha observado que las proteínas fusionadas a ellas cambian su grado de hidrofobicidad y pueden ser separadas fácilmente en sistemas de dos fases acuosas, principalmente en aquellos basados en surfactantes no-iónicos.Metodología.Para la expresión de la proteína se utilizó la cepa Pichia pastoris cepa X-33, y el plásmido PICZa. En este plásmido la proteína de interés se expresa fusionada en el N-terminal con la secuencia alfa del factor de secreción de Saccharomyces cerevisiae, favoreciendo la liberación de la proteína heteróloga al medio de cultivo. La transformación y expresión se llevó a cabo según el manual del fabricante. Se detectó la presencia de la proteína heteróloga en el sobrenadante de cultivo. Se llevó a cabo la purificación mediante dos fases acuosas ex situ para determinar la concentración óptima a utilizar de surfactante no-iónico Luego de la separación de fases, a la fase con detergente se le agregó isobutanol para recuperar la proteína. Tras esta segunda separación de fases, se obtuvo una segunda fase acuosa donde se observó la proteína purificada. La concentración de proteínas totales solubles (PTS) será determinada por el método de Bradford (1976). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE usando gel de poliacrilamida al 15% (v / v) siguiendo el protocolo descrito por Laemmli et al. (1970)Resultados y Discusión.La proteína de fusión, DomIIIcHFBI particionó a la fase rica en detergente a las tres concentraciones de Triton X-114 probadas (2, 5 y 8%). La purificación de proteínas alcanzó una mayor concentración cuando se usó Triton X-114 al 2%. No hubo pérdida significativa de la proteína en la primera fase acuosa. En una etapa de purificación, DomIIIcHFBI se enriqueció 2,9 veces en el ATPS en relación con el sobrenadante originalA continuación, para integrar los procesos de producción y purificación, desarrollamos una estrategia ISPR. En base a los resultados previos, se añadió una concentración final de 2% de Triton X-114 directamente a los cultivos. Para realizar la fermentación extractiva, la biocompatibilidad de los tensioactivos no iónicos con el microorganismo es fundamental, por lo que se evaluó el transcurso del tiempo de crecimiento de la levadura en un medio que contiene el surfactante Los cultivos en presencia del 2% de Triton X-114 mostraron perfiles de crecimiento similares a los de los controles. Esto indica que la adición de Triton X-114 al cultivo no es tóxica para las células en las condiciones probadas. El análisis de SDS-PAGE y Western Blot permitió identificar DomIIIcHFBI en la segunda fase acuosa de los cultivos después de la adición de isobutanol, y no hubo pérdida de la proteína en la primera fase acuosa Estos resultados confirmaron que durante el cultivo extractivo con P. pastoris, la proteína particionó a la fase rica en detergente y su expresión no se alteróPara determinar el recubrimiento óptimo de las placas multiwell de Polysorp para favorecer la inmovilización de proteínas hidrofóbicas, se analizaron concentraciones de proteína de 0,078 μg / pocillo a 12 μg / pocillo. Hemos informado anteriormente de que la hidrofobina promueve la unión efectiva de antígenos a soportes hidrofóbicos, cuando se compara la inmovilización del antígeno libre con respecto a la que tiene la etiqueta. De acuerdo con la OD más alta obtenida con la concentración más baja de antígeno, se determinó que una concentración de antígeno de 0.625 μg / pocillo fue la óptima.Para analizar si la inmovilización se vio afectada por el proceso de purificación, llevamos a cabo un ensayo en paralelo con un kit de diagnóstico comercial para la detección de IgG anti-dengue en muestras de suero. El kit comercial incluye un control positivo y uno negativo. Por lo tanto, comparamos los resultados obtenidos al probar estos controles con los reactivos comerciales y con las placas desarrolladas internamente recubiertas con el antígeno eliminado in situ u obtenido por ATPS, con 0,625 μg / pocillo de proteína. Los criterios de rendimiento establecidos en la hoja de datos de QC del reactivo comercial establecen que el control negativo debe dar lecturas de DO menores a 0.20 y que las lecturas de DO de control positivo deben estar entre 0.65 y 3.00. Estos criterios se cumplieron tanto con el kit comercial, que validó los resultados obtenidos, como con las determinaciones internas, que mostraron valores similares para los antígenos obtenidos por remoción in situ y por ATPS.Conclusión.Expresamos el consenso del dominio de la proteína E del virus del dengue III fusionado a la hidrofobina (DomIIIcHFBI) en Pichia pastoris. La proteína de fusión se purificó mediante ATPS y, en un paso, enriquecimos la proteína 2,9 veces directamente del sobrenadante.El principal hallazgo de este trabajo es que la proteína de fusión se eliminó in situ de forma eficiente del sobrenadante durante el proceso de fermentación mediante la incorporación de Triton X-114, sin generar toxicidad para las células de levadura. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se informa una eliminación in situ de una proteína heteróloga fusionada a HFB en cultivo de Pichia pastoris usando Triton X-114 basado en surfactante ATPS.La integración de los procesos ascendente y descendente desarrollados en este trabajo podría convertirse en una estrategia alternativa para la expresión y purificación de otras proteínas recombinantes utilizando Pichia pastoris como un sistema de expresión.