NANOSISTEMAS DE FENAZINA COMO POTENCIALES AGENTES SELECTIVOS EN CONDICIONES DE HIPOXIA PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE MAMA

SANCHÉZ, C; CERECETTO H.; DAVILA, B; CABRAL, P.; GLISONI, RJ; LECOT, N.; FERNANDEZ LOMONACO, M; GONZÁLEZ M.

CABA, Buenos Aires, Argentina

Jornada; 161° JORNADA CIENTÍFICA ESTADO ACTUAL DE LA NANOTECNOLOGIA y SUS APLICACIONES EN LAS CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS; 2017

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica 2017

Introducción. El cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres, con un aumento en los países en desarrollo, principalmente porque el diagnóstico se hace en las últimas etapas de la enfermedad [1]. El cáncer de mama es un tumor sólido que se caracteriza por un alto grado de zonas hipóxicas difícilmente tratables. Recientemente, hemos sintetizado un nuevo derivado de fenazina (FNZ; N5,N10-dióxido de 2-amino-7(8) -fluorofenazina), con buenos rendimientos sintéticos (~60%), que actúa como un agente selectivo en condiciones de hipoxia, considerado una de las dianas terapéuticas alternativas en el tratamiento de tumores sólidos [2,3]. Con el objetivo de aumentar la solubilidad acuosa de FNZ (208±31g/mL) y mejorar ciertos obstáculos existentes en la terapia antitumoral actual como una biodistribución no-específica, concentraciones intratumorales bajas o insuficientes y resistencia desarrollada por parte de ciertas células tumorales al tratamiento convencional, es que resultó de nuestro interés explorar la encapsulación de FNZ en micelas poliméricas (PMs) a base de poli(óxido de etileno)-b-poli(óxido de propileno) (PEO-PPO) y sus derivados glucosilados (Glu) [4,5]. Las PMs ofrecen diversas ventajas debido a sus propiedades singulares, incluyendo: (i) una buena estabilidad en agua por encima de su concentración micelar crítica (CMC), (ii) cargas de fármaco en el núcleo elevadas, (iii) la capacidad de modificar su superficie con una diversidad de ligandos activos y (iv) tamaños nanométricos, que son adecuados para aprovechar el efecto de permeación y retención mejorada (EPR) para el tratamiento del cáncer [6]. EPR es el único fenómeno que capitaliza las características de los tumores sólidos, relacionadas con las diferencias anatómicas y fisiopatológicas que poseen con los tejidos normales. Además del efecto EPR, la envoltura/núcleo de las PEO-PPO PMs proporcionaría una semivida más larga en circulación y la glucosilación no sólo estabilizaría el sistema coloidal debido a formación de múltiples enlaces de hidrógeno en la corona micelar, sino que también favorecería la internalización y la potencial acumulación en el tumor [5,7]. Por último, y para optimizar la estabilidad de la solubilidad de FNZ alcanzada con las PMs, se exploró por primera vez según nuestro conocimiento, la hidratación de PEO-PPO PMs utilizando liposomas-pegilados (LPS) preformados, con resultados muy alentadores.Materiales y Métodos Caracterización Fisicoquímica. Se prepararon PMs vacías (15% p/v) a base de F127, F127-Glu, T1307, T1307-Glu y mezcla T1307:F127 (50:50) y sus respectivas PMs cargadas (15% p/v) con FNZ (2 mg/mL). Por otro lado, se exploró la hidratación de F127 y T1307 (10% p/v) utilizando LPS preformados a base de fosfatidilcolina de soja y colesterol. En este caso, los sistemas vacíos fueron llamados F127:LPS y T1307:LPS y aquellos cargados con FNZ (2 mg/mL): F127:LPS/FNZ y T1307:LPS/FNZ, respectivamente. Todos los sistemas fueron caracterizados por Dynamic Light Scattering (DLS, tamaño hidrodinámico promedio, índice de polidispersión (PDI) y potencial-Zeta) y por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). Análisis de la Viabilidad Celular In Vitro. Se utilizaron células NIH 3T3 (normales) y 4T1 (células de tumor de mama murino símil estadio IV humano) con el siguiente protocolo de tratamiento (FNZ: 0-40 M): (i) FNZ-libre, (ii) nanosistemas vacíos, (iii) nanosistemas cargados con FNZ y (iv) controles sin tratamiento (tres ensayos colorimétricos MTT por cuadruplicado).Estudios In Vivo. Toxicidad Aguda en animales. Se trabajó con un grupo de ratones BALB/c sanos de 2 meses de edad. Posología: PMs vacías y cargadas (dosis única: 2000 mg/kg ratón) con FNZ (dosis única: 20 mg/kg ratón) y volumen de inyección (185 L) por vía intraperitoneal (IP). Se evalúa la sobrevida de los animales durante 14 días, y siguiendo el protocolo de Irwin antes y después de la dosificación como: modificaciones de la piel y del pelo, los ojos, las mucosas, el aparato respiratorio, actividad somato-motriz, comportamiento, entre otras. Evaluación de la reducción de volumen tumoral. A partir de los resultados obtenidos de la caracterización y estabilidad fisicoquímica, evaluación de la actividad antitumoral in vitro (viabilidad celular) y estudios de toxicidad aguda, se seleccionaron los nanosistemas óptimos y más seguros y se trataron ratones BALB/c inducidos con tumor de mama 4T1, por vía IP, con las siguientes preparaciones: (i) T1307:F127 (50:50), (ii) T1307:F127/FNZ (50:50) y (iii) controles sin tratamiento (n=3, en cada caso). La posología de FNZ fue de 20 mg/kg ratón, dosis única diaria con descanso de un día (sin inyección). Posteriormente, a los 18 días de tratamiento, se procedió a sacrificar por dislocación cervical y necropsia y se obtuvieron las imágenes ex vivo de los ratones BALB/c con tumor de mama inducido 4T1. Es así, que se inoculan las células en los ratones BALB/c, se aguarda el periodo de implantación del tumor (4 días) y se procede al inicio del tratamiento. Se mide el diámetro mayor y menor con un calibrador vernier (Ostrand-Rosenberg) antes de cada día de tratamiento, teniendo en cuenta la reducción al final del estudio, para la valoración sobre la eficacia del mismo.ResultadosLas PMs vacías y cargadas con FNZ presentaron distribuciones de tamaño uniforme, índices de polidispersión (PDI) < 0,5 y Zeta-potenciales levemente negativos, que muestran ser compatibles con sistemas estables y que aumentaron hasta 10 veces la solubilidad de FNZ en agua. Se analizaron las estructuras cargadas con FNZ por TEM, en las que se observó morfologías esféricas del orden de los nanómetros. FNZ-libre no afecta la viabilidad celular en células normales NIH 3T3 y disminuye la misma al aumentar su concentración en células tumorales 4T1. Las PMs vacías no afectan las células NIH 3T3, mientras que PMs cargadas con FNZ, disminuyeron la viabilidad celular en células 4T1 a concentraciones menores del 50% y concentraciones de FNZ de ~30M. Por último, los tratamientos realizados en ratones BALB/c con tumor de mama inducido 4T1, utilizando las preparaciones más promisorias y seguras (T1307:F127, así como sus respectivos sistemas cargados con FNZ), mostraron que se obtuvo una disminución del volumen de la masa tumoral en aquellos ratones que fueron tratados con T1307:F127/FNZ (Figura 1).Figura 1. Imagen ex vivo de: (A) control del tumor sin tratamiento y (B) tumor post-tratamiento con T137:F127/FNZ.Conclusiones y PerspectivasFNZ es un potencial agente antitumoral que combina la capacidad de intercalarse al ADN con un mecanismo de citoxicidad selectivo en hipoxia. Su baja solubilidad en medios acuosos hace necesaria la implementación de estrategias nanotecnológicas para poder llevar adelante sus evaluaciones biológicas in vitro e in vivo. Las PMs prístinas, sus mezclas, como aquellas glucosiladas desplegaron alta capacidad de solubilización de FNZ y la estabilidad de estos sistemas se vio favorecida con la incorporación de LPS al medio. Si bien se requieren estudios más exhaustivos sobre la capacidad de estos nanosistemas cargados con FNZ para producir reducción considerable de la masa tumoral en ratones inducidos con tumor de mama 4T1, los resultados obtenidos hasta el momento indicarían la potencialidad de estos sistemas como agentes terapéuticos selectivos en condiciones hipóxicas en cáncer de mama.