Diseño de una nueva plataforma de expresión de proteínas de membrana utilizando como modelo al ciliado Tetrahymena thermophila

TOMAZIC M; CLARA B NUDEL; EUGENIA ELGUERO; MARÍA G MONTES; MARÍA L SANCHEZ GRANEL; ALEJANDRO D NUSBLAT; NICOLAS G CID; LEONHARD SCHNITTGER

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; 9°Congreso y Exposición para la Ciencia y Tecnología Farmacéutica, Biotecnológica, Veterinaria y Cosmética; 2016

Tetrahymena thermophila es un protozoo ciliado que vive en aguas abiertas como hábitat natural. Es capaz de crecer en cultivos axénicos en medios definidos y económicos. Tiene un ciclo de duplicación corto y altas densidades de crecimiento de manera que permite fácilmente el escalado en biorreactores. A su vez, constituye un sistema para la expresión de proteínas de alta complejidad, ya sea por su plegamiento o sus modificaciones postraduccionales. Sobre la base de sus características específicas este organismo constituye una fuerte herramienta biotecnológica para la generación de anticuerpos monoclonales y enzimas. En este trabajo se presenta a T. thermophila como modelo para la producción de candidatos vacunales de aplicación veterinaria. En particular, se centra en la expresión heteróloga de antígenos que poseen anclaje a membrana de tipo glicosilfosfatidilinositol (GPI) para patógenos protozoarios Babesia bovis y Cryptosporidium parvum. Con este fin, se eligió un prominente candidato vacunal para cada patógeno, MSA-2c en el caso de B. bovis y GP60 de C. parvum, para su expresión con ancla GPI en T. thermophila. Las moléculas de GPI han mostrado ser unos de los más potentes inmunomoduladores conocidos.Mediante una estrategia genética de vectores episomales de rADN se logró la transformación de T. thermophila con los antígenos GP60 y MSA-2c bajo el promotor del gen de la metalotionina 1 (Mtt1) inducible por metales pesados. Los clones obtenidos para cada antígeno se seleccionaron por resistencia a paramomicina y fueron inducidos con 5ug/ml de CdCl2. Se analizó mediante western blot con anticuerposespecíficos la presencia de las proteínas heterólogas en fracciones de células totales y enriquecidas en membranas, obteniéndose resultados positivos confirmados por espectrometría de masa. En paralelo, se optimizaron los parámetros para el escalado del cultivo a biorreactor de un litro. Estos resultados ponen en evidencia la capacidad de T. thermophila de expresar proteínas recombinantes y sientan las bases para utilizar este ciliado como plataforma biotecnológica para la producción de candidatos vacunales.