Expresión y purificación del Dominio III consenso del virus del dengue utilizando el sistema baculovirus en células de insectos

MARÍA EMILIA SMITH; JULIETA CEREZO; MARIA VICTORIA MIRANDA; ALEXANDRA MARISA TARGOVNIK; JULIAN RODRIGUES TALOU

Ciudad autónoma de Buenos Aires

Congreso; 10mo Congreso y Exposición para la Ciencia y Tecnología Farmacéutica, Tecnología, Veterinaria y Cosmética; 2016

El virus del dengue pertenece a la familia Flaviviridae y presentacuatro serotipos antigénicamente diferentes. Es unvirus de RNA simple cadena y su genoma codifica para unapoliproteína que tras su clivado da origen a tres proteínasestructurales cápside (C), membrana (M) y envoltura (E);y a siete proteínas no estructurales. La proteína E poseetres dominios, el dominio III (DomIII) contiene múltiplesepítopes neutralizantes que son serotipo-específicos. Estedominio es más fácil de producir en sistemas recombinantespor su menor tamaño y, además, carece de otrosepitopes que desencadenan anticuerpos no neutralizantesde reactividad cruzada.Recientemente ha sido descripta una secuencia consensodel DomIII, basándose en el DomIII de la proteína E dedistintas variedades de cada serotipo de todo el mundo, lacual demostró capacidad de generar una respuesta inmunecontra todos los serotipos.Las hidrofobinas son proteínas anfifílicas de entre 7.5 ? 10kDa, producidas por hongos filamentosos. Se ha observadoque las proteínas fusionadas a ellas ven alterada su hidrofobicidady pueden ser separadas fácilmente en sistemasde dos fases acuosas (ATPS), principalmente en aquellosbasados en surfactantes no-iónicos.El objetivo de este trabajo es expresar la secuencia consensodel Dom III fusionada a hidrofobina (DomIIIcHFB)utilizando el sistema baculovirus en células de insectosy purificar la proteína mediante un sistema de dos fasesacuosas, con el fin último de desarrollar un kit diagnóstico.Metodología:Mediante síntesis química (Genscrip), se obtuvo la secuenciaDom III consenso fusionada a hidrofobina. La secuenciafue clonada en el vector de transferencia pAcGP67-B, quecontiene el péptido señal de la glicoproteína acídica gp67para la secreción de las proteínas al medio extracelular,bajo el promotor fuerte de poliedrina viral. Por cotransfeccióncon el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen)se obtuvo el baculovirus recombinantes en la línea celularSf9. El baculovirus recombinante fue amplificado para obtenerstocks virales de alto título y titulado por la técnicadel punto final. Se infectaron cultivos de células Sf9 conel baculovirus recombinante, probando distintas multipliexpresión en el medio de cultivo, tomando muestra cada24 horas por 4 días.Sobre los sobrenadantes de las células de insecto, sellevó a cabo la purificación mediante dos fases acuosas.Para ello, a las muestras se les agregó Triton X-114 a unaconcentración del 4%. Luego de la separación de fases, a lafase con detergente se le agregó isobutanol para recuperarla proteína. Luego de esta segunda separación de fases,se obtuvo una segunda fase acuosa donde se espera quese encuentre la proteína purificada. En esta separaciónde fases se formó una interfase, que fue recuperada parasu análisis. Las muestras se analizaron por SDS-Page yWestern Blot, utilizando un suero de conejo policlonal anti-Dengue (Ab9200, Abcam).Resultados y Discusión:Se obtuvieron los vectores de transferencia y con ellos losbaculovirus recombinantes para la expresión del DomIIIcHFBen células de insecto.Al utilizar una moi de 0.5 se observó la presencia de laproteína, mediante Western Blot, a partir del tercer día postinfección y una banda de mayor intensidad al cuarto día.Al infectar las células con una moi de 2 se observó la presenciade la proteína por esta técnica a partir del segundodía, siendo más intensa en el tercer día post infección. Alrealizar el SDS-Page de estas muestras no se observó labanda correspondiente al peso molecular esperado de laproteína (21kDa). Se determinó como condición de expresiónóptima moi 0.5 y como tiempo de cosecha el cuarto díapost infección, al obtener mayor producción de la proteína.Al realizar la purificación mediante dos fases acuosas, seevidenció la presencia de la proteína por Western Blot en lasegunda fase acuosa y en la interfase formada. Medianteel SDS Page, se visualizó una banda correspondiente alpeso molecular esperado de la proteína en la interfase.Conclusiones:Se logró expresar la proteína recombinante exitosamenteen células de insecto, mediante el sistema de baculovirus.La proteína fue purificada parcialmente por ATPS utilizandoTritón X-114 al 4%. Actualmente estamosoptimizando estaestrategia de purificación.