EXPRESIÓN DE UN ANTÍGENO DEL VIRUS DEL DENGUE EN CÉLULAS Y LARVAS DE INSECTOS FUSIONADO A HIDROFOBINA PARA SU PURIFICACIÓN DIRECTA EN SISTEMAS DE DOS FASES ACUOSAS

MARÍA EMILIA SMITH; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; MARÍA VICTORIA MIRANDA; JULIÁN RODRIGUEZ TALOU

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

El virus del Dengue pertenece al género Flavivirus y su genoma codifica para 3 proteínas estructurales. De ellas, la proteína de la Envoltura es la más abundante e inmunogénica. Su Dominio III (DomIII) contiene epitopes que generan anticuerpos neutralizantes serotipo específicos. Las hidrofobinas (HFB) son proteínas anfifílicas producidas por hongos filamentosos. Han sido descriptas como eficientes tags para la purificación de proteínas recombinantes por sistemas de dos fases acuosas (ATPS) basados en surfactantes no iónicos. Además, permiten la inmovilización de manera orientada de los antígenos fusionados a ellas en soportes sólidos empleados en kits de diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión y purificación de DomIII fusionado a HFB en el sistema baculovirus/células de insecto. Esta proteína posee una potencial aplicación biotecnológica orientada hacia el desarrollo de una vacuna y kits diagnósticos. Metodología Se construyó un vector de transferencia clonando la secuencia codificante del DomIII fusionado a HFB en el plásmido pAcGP67-B. Por cotransfección de este vector con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) en la línea celular Sf9 se obtuvieron los baculovirus recombinantes. Se infectaron cultivos de células Sf9 con el baculovirus recombinante y se evaluó la cinética de expresión con 2 multiplicidades de infección (MOI 0.5 y 2). Luego se evaluó la purificación de DomIIIHFB por ATPS ensayando tres concentraciones de Tritón X-114: 2%, 5% y 8%. Por otro lado, se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante en larvas de Rachiplusia nu y se evaluó su purificación por ATPS. En todos los casos la detección y análisis de las proteínas recombinantes se llevó a cabo por SDS-PAGE y Western Blot. Resultados Se logró obtener un baculovirus recombinante para la expresión de DomIII-HFB. Se evaluó la expresión en la línea celular Sf9 y se vio que la proteína era mayormente liberada al medio de cultivo. En este sistema las condiciones óptimas de expresión fueron con MOI 0,5 y cosecha a los 2 días postinfección. Por medio de ATPS se logró purificar parcialmente DomIII-HFB desde el medio de cultivo. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando una concentración de Tritón X-114 del 2%. Se evaluó la expresión de DomIII-HFB en larvas de Rachiplusia nu obteniéndose altos niveles de expresión y se logró purificar parcialmente la proteína por ATPS. Conclusiones Los resultados expuestos en el presente trabajo indican que el sistema de expresión baculovirus/células de insecto resulta adecuado para la producción de antígenos del virus del Dengue como proteínas fusionadas a HFB, permitiendo de esta manera su purificación por medio de sistemas de dos fases acuosas de manera fácil y económica. La expresión en larvas demostró ser un sistema adecuado para el escalado de este proceso.