PRODUCCIÓN DE UN ANTÍGENO DEL VIRUS DEL DENGUE EN LARVAS DE INSECTO PARA EL DESARROLLO DE UN KIT DE DIAGNÓSTICO DE BAJO COSTO

SMITH ME; TARGOVNIK AM; MIRANDA MV; RODRIGUEZ TALOU J

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; XII Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial, JorFyBI 2015; 2015

INTRODUCCIÓNEl Dengue es una enfermedad viral transmitida a los humanos por mosquitos del género Aedes. Sus presentaciones clínicas varían desde una fiebre indiferenciada hasta la fiebre por dengue y sus formas más severas, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de shock por dengue. Dado que hasta el momento no existe una vacuna en el mercado ni tratamiento específico para la enfermedad es que un diagnóstico temprano es de vital importancia para el manejo de la enfermedad. El virus del Dengue pertenece al género Flavivirus y su genoma codifica para tres proteínas estructurales. De ellas, la proteína de la envoltura es la más abundante e inmunogénica. Su dominio III (DomIII) contiene epitopes que generan anticuerpos serotipo específico siendo por esto un target interesante para el desarrollo de vacunas y reactivos de diagnóstico.Por otra parte, las hidrofobinas (HFB) son proteínas anfifílicas producidas por hongos filamentosos que debido a sus características fisicoquímicas han sido descriptas como eficientes tags para la purificación de proteínas recombinantes en sistemas de dos fases acuosas (ATPS) basados en surfactantes no iónicos. Además, permiten la inmovilización de los antígenos fusionados a ellas en soportes sólidos comúnmente empleados en kits de diagnóstico de manera eficiente y correctamente orientada.El objetivo de este trabajo es la expresión y purificación de DomIII recombinante fusionado a HFB (rDomIIIHDB) para el desarrollo de un kit de diagnóstico para la detección de inmunoglobulinas anti-Dengue, utilizando el sistema baculovirus-larvas de insecto. MATERIALES Y MÉTODOS Obtención del baculovirus recombinante: Se construyó un vector de transferencia clonando la secuencia codificante de DomIII fusionado a HFB en el vector pAcGP67-B. La construcción pAcGPDomIIIHFB se cotransfectó con el ADN viral linealizado de AcMNPV (Autographa californica) BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) en la línea celular Sf9 para obtener el baculovirus recombinante, el cual fue amplificado y titulado por la técnica del punto final. Expresión: Se infectaron larvas de Rachiplusia nu vía intrahemocele con el baculovirus recombinante. Las mismas fueron mantenidas a 23-25 °C en cámara de cultivo acondicionada con fotoperiodo y alimentadas con una dieta artificial. Al día 3 postinfección se extrajeron las proteínas totales de la larva ensayando diferentes procedimientos: PBS; PBS y sonicado; Tris 3% SDS 1mM DTT y sonicado.Purificación: La purificación se llevó a cabo por ATPS utilizando el surfactante no iónico Tritón X-114. Para ello, se ensayaron tres concentraciones de surfactante 2%, 5% y 8%, el cual fue adicionado directamente en los extractos obtenidos de las larvas sin acondicionamiento previo. La recuperación de las proteínas recombinantes de la fase surfactante se realizó por medio del agregado de isobutanol. Detección y análisis de las proteínas recombinantes: Se llevó a cabo por SDS-PAGE y Western Blot, utilizando un suero de conejo policlonal anti-Dengue (Ab9200, Abcam). La evaluación de la pureza del producto obtenido se realizó por densitometría de gel utilizando el programa ImageJ. La cuantificación de las proteínas totales se realizó por el método de Bradford.Inmovilización en soportes sólidos: con el objetivo de desarrollar un enzimoinmunoensayo en fase sólida (ELISA) para la detección de inmunoglobulinas anti-Dengue en el suero de pacientes infectados, se evaluó la inmovilización de rDomIIIHFB en placas de 96 pocillos. Para ello, las concentraciones de antígeno a inmovilizar ensayadas fueron entre 0,1 y 50 ug/ml. Un estándar comercial de DomIII (Prospec) se ensayó en paralelo en las mismas concentraciones. La detección del antígeno inmovilizado se realizó con el anticuerpo Ab9200 (Abcam) y un suero anti-Ig de conejo conjugado con peroxidasa, utilizando el reactivo TMB (Life Technologies).RESULTADOSSe logró obtener un baculovirus recombinante para la expresión de rDomIIIHFB con alto título (1,1 x 108 UFP/ml). Las larvas de R. nu infectadas con este stock viral expresaron altos niveles de proteína recombinante en hemolinfa. El rDomIIIHFB se extrajo eficientemente por homogenización de las larvas con PBS. Se evaluó la purificación de rDomIIIHFB por ATPS con Tritón X-114 y se vio que la proteína particiona en la fase detergente. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando una concentración de Tritón X-114 del 2%. En estas condiciones, la pureza obtenida fue del 80% y el rendimiento de 656 ug/larva. Se estudió la utilidad de rDomIIIHFB en el desarrollo de un ELISA para la detección de inmunoglobulinas anti-Dengue. Al comparar la eficiencia de inmovilización de rDomIIIHFB con un estándar comercial de DomIII, se obtuvieron resultados significativamente mejores con el antígeno fusionado a HFB. La concentración óptima de antígeno para la sensibilización de las placas resultó ser 6,25 ug/ml. En resumen, con la masa de antígeno purificado obtenido de una larva se pueden sensibilizar 22 placas de 96 pocillos.CONCLUSIONESLos resultados expuestos en el presente trabajo indican que el sistema de expresión baculovirus/larvas de insecto resulta adecuado para la producción de DomIII fusionado a HFB, permitiendo de esta manera su purificación por medio de sistemas de dos fases acuosas de manera simple y económica. Tanto el sistema de expresión como el método de purificación empleados resultan alternativas promisorias para la producción a gran escala. Por otro lado, los resultados obtenidos indican que HFB mejora la inmovilización del antígeno a soportes sólidos, poniendo en evidencia la utilidad del antígeno producido para el desarrollo de un kit de diagnóstico para la detección de inmunoglobulinas anti-Dengue en sueros de pacientes infectados.