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IntroducciónEl interferón beta felino (fIFNβ) pertenece a los interferones de tipo I, que son citoquinassecretadas por células en respuesta a infecciones virales, así como a otros microorganismos y suscomponentes (oligosacáridos bacterianos, oligonucleótidos, material genético extraño, hongos). Essabido que inducen un amplio rango de efectos: antivirales, antitumorales, antiparasitarios einmunomoduladores. En veterinaria, la administración de interferones humanos recombinantes (hIFNαy hIFNβ) conlleva un alto costo y además genera reacciones adversas. La mejor opción actualmentepara reducir la mortalidad y los signos clínicos de ciertas infecciones virales, como la parvovirosiscanina, la leucemia felina viral o la inmunodeficiencia felina viral, es la administración de interferónomega felino (fIFNω) que se comercializa en Europa (Virbagen Omega, Virbac). Dada la necesidad decontar con nuevos biofármacos para la industria veterinaria local, en este trabajo se desarrolló unmétodo biotecnológico para la expresión y purificación de fIFNβ recombinante, en el sistemabaculovirus-larvas de insecto. Las larvas utilizadas resultan de particular interés como plataforma parala producción heteróloga de proteínas, ya que constituyen una plaga que afecta numerosos cultivos ennuestro país, resultando fáciles de conseguir y de bajo costo.Materiales y métodosEl gen sintético de fIFNβ contenido en el vector de clonado pUC18, se sub-clonó en el vectorde transferencia pAcGP67-B. El fIFNβ quedó clonado bajo el promotor de poliedrina y la secuenciaseñal viral gp67 que direcciona a la proteína al espacio extracelular.Posteriormente se procedió a construir el baculovirus recombinante. Para ello, un cultivo decélulas Sf9 en monocapa se co-transfectó con el vector de transferencia recombinante y el genomalinealizado del baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus - AcNPV(BaculoGold?,BD Biosciences), mediante liposomas. El BaculoGold? porta dos característicasútiles: i) codifica para la Green Fluorescent Protein (GFP) como gen reportero, y ii) una deleción letalque sólo es salvada mediante la recombinación homóloga, así todo virus presente en el sobrenadante deco-transfección es recombinante (AcNPV-IFN) y la purificación de virus es innecesaria.Para generar un stock viral de alto título, el sobrenadante de co-transfección fue utilizado paratres rondas sucesivas de amplificación en Sf9 en monocapa. Luego, se lo tituló por punto final.Larvas de Spodoptera frugiperda en el quinto estadío (300 mg) fueron infectadas víaintrahemocele con AcNPV-IFN, y al quinto día post-infección (d.p.i) se cosecharon las larvasfluorescentes bajo luz UV y se mantuvieron a -20°C. El extracto larval se obtuvo por homogeneizaciónde larvas congeladas en mortero, con buffer fosfato pH=7,0, centrifugación y descarte del pellet.La purificación de la proteína de interés se realizó por cromatografía de pseudo-afinidad enmatrices de Blue-Sepharose. Se sembró el extracto larval en buffer fosfato pH= 7,2, se realizaronlavados con [NaCl]= 0,5 M, y se eluyó la proteína con [NaCl]=1M, en el equipo ÄKTA Purifier (GEHealthcare).Todo el proceso se analizó por SDS-PAGE 15% con tinción con Coomasie-Blue, o bien serealizó un Western Blot con anticuerpos específicos.La actividad biológica del interferón beta felino recombinante (rfIFNβ) purificado se ensayó invitro. Por un lado, se expusieron células de carcinoma mamario felino a rfIFNβ, y se cuantificó ladisminución del número de células viables contra un control sin tratamiento (actividad antitumoral).Por otro lado, se desafió con el Virus de Estomatitis Vesicular (VSV) a fibroblastos de riñón de gato(Crandell Reese Feline Kidney, CRFK) pretratados el día anterior con rfIFNβ en diluciones seriadas½. La actividad antiviral se expresó como título, en unidades internacionales por mL (UI/mL) a partirde una curva de Virbagen Omega, de título conocido.Además, en el producto purificado se analizó la presencia de DNA viral por PCR y geles deagarosa al 1%.ResultadosLa fluorescencia verde observada bajo luz UV de las células Sf9 en cultivo evidenció que la cotransfeccióny recombinación homóloga habían sido exitosas. La proteína de interés se expresócorrectamente bajo el promotor de poliedrina, y la secuencia señal gp67 la direccionó al espacioextracelular, haciéndola fácil de extraer luego de la homogeneización de las larvas enteras. Esteresultado surge del revelado de western blot usando anticuerpos primarios específicos anti-fIFNβ.La utilización de cromatografía de Blue-Sepharose permitió la purificación del rfIFNβ en unsolo paso, y en las condiciones del ensayo la mayoría de las proteínas contaminantes no se adsorbierona la matriz. La presencia de rfIFNβ en el eluido se evidenció por western blot, y la pureza del productose comprobó por geles SDS-PAGE.Finalmente, el rfIFNβ purificado no presenta contaminación con proteínas inmunogénicas de lalarva, según el ensayo de western blot con anticuerpos primarios anti-proteínas de larva S. frugiperda.Tampoco se detectó contaminación con DNA proveniente de baculovirus. Además, presentó una altaactividad biológica: actividad antiviral de 5x104 UFP/mL, comparable con la de Virbagen Omega, yactividad antitumoral superior a éste, disminuyendo la viabilidad celular más del 60%..ConclusionesLos resultados de este trabajo sientan las bases para el desarrollo de un proceso biotecnológicooriginal basado en larvas de insecto, para la producción de un nuevo biofármaco para uso veterinario.